上皮性卵巢癌中Let-7a及其靶基因HMGA2、Cyclin D1的表达*

李 莉，贾 慧，李保平，李晓珍，孙 玮，臧星卉，李红雨，DUAN Zhenfeng，郭玉琪

1)郑州大学第三附属医院妇产科 郑州 450052 2)美国哈佛大学麻省总医院肉瘤实验室 美国 波士顿 MA02114 3)河南省妇科肿瘤纳米医学国际联合实验室 郑州 450003

上皮性卵巢癌中Let-7a及其靶基因HMGA2、Cyclin D1的表达*

李 莉1)，贾 慧1)，李保平1)，李晓珍1)，孙 玮1)，臧星卉1)，李红雨1)，DUAN Zhenfeng2)，郭玉琪1，3)#

1)郑州大学第三附属医院妇产科 郑州 450052 2)美国哈佛大学麻省总医院肉瘤实验室 美国 波士顿 MA02114 3)河南省妇科肿瘤纳米医学国际联合实验室 郑州 450003

#通信作者，女，1964年1月生，博士，教授，主任医师，研究方向：卵巢癌与多药耐药，E-mail：yuqi-guo@163.com

上皮性卵巢癌；let-7a；高迁移率蛋白A2；细胞周期蛋白D1

目的：探讨上皮性卵巢癌患者血浆和组织中let-7a的表达水平及意义。方法：采集48例上皮性卵巢癌患者的血浆和癌组织、同时期与卵巢癌患者年龄性别匹配的23例健康体检者的血浆和26例因子宫等良性疾病切除的正常卵巢组织，采用qRT-PCR法检测血浆及组织中let-7a和高迁移率蛋白A2(HMGA2)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1) mRNA的表达，采用免疫组化法检测组织中HMGA2和Cyclin D1蛋白的表达。结果：卵巢癌患者血浆及组织中let-7a的表达均低于正常(P<0.05)，血浆及组织中let-7a的表达无相关性(r=0.163,P=0.270)；以血浆let-7a水平诊断卵巢癌的ROC曲线下面积为0.826(95%CI为0.728～0.923)。HMGA2、Cyclin D1 mRNA及蛋白在癌组织中的表达高于正常(P<0.05)。组织中let-7a和HMGA2、Cyclin D1 mRNA及蛋白的表达与FIGO分期、淋巴结转移有关(P<0.05)。卵巢癌组织中let-7a与HMGA2、Cyclin D1 mRNA的表达呈负相关(r=-0.729、-0.735,P<0.001)。结论：血浆let-7a表达水平对上皮性卵巢癌有一定的诊断价值；Let-7a及其靶基因HMGA2和Cyclin D1共同参与了上皮性卵巢癌的发生发展。

卵巢癌在女性生殖系统肿瘤中发病率居于第四位，病死率却高居首位，目前只有25%的患者可以在FIGO(2013)Ⅰ、Ⅱ期被确诊，超过70%的患者确诊时已是晚期(FIGO Ⅲ、Ⅳ期)，晚期患者的5 a生存率约为30%[1]。对于晚期患者，治疗最主要的障碍是缺乏早期诊断指标和多药耐药的发生[2-3]。miRNA作为重要的基因表达调控分子，通过与靶点mRNA碱基互补配对，降解相应的mRNA或阻遏其翻译过程，从而调控基因表达，与肿瘤发生、发展和化疗耐药关系密切[4]。最近研究[5]发现，从人体液循环中可以检测到miRNA，提示miRNA可能成为一种新的诊断指标，辅助肿瘤的早期诊断与治疗。let-7a是miRNA家族中的一员，其在多种肿瘤如乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌组织中表达下调[6-7]。研究[3,8]证实，高迁移率蛋白A2(HMGA2)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)作为let-7a下游的靶点，与恶性肿瘤的发生、组织学类型、分化程度、侵袭性及患者预后关系密切。该研究对上皮性卵巢癌患者血浆及肿瘤组织中let-7a、HMGA2、Cyclin D1的表达进行了分析，评估血浆let-7a对上皮性卵巢癌的诊断价值，探讨其在卵巢癌发生发展过程中可能发挥的作用。

1 材料与方法

1.1 一般资料 收集2014年9月至2016年5月于郑州大学第三附属医院就诊的上皮性卵巢癌患者48例(卵巢癌组)，均经术后病理证实诊断，年龄22～76岁；FIGO分期Ⅰ期5例，Ⅱ期13例，Ⅲ期19例，Ⅳ期11例；浆液性囊腺癌22例，黏液性囊腺癌18例，子宫内膜样癌6例，透明细胞癌2例；无淋巴结转移19例，有淋巴结转移29例；术前均未行化疗或放疗。采集患者血液及手术当日采集的适量癌组织标本。收集同时期与卵巢癌组患者年龄、性别匹配的23例健康体检者的血液和同期26例因子宫良性病变等原因行卵巢切除术者的正常卵巢组织(术后经病理证实)为对照。

1.2 标本处理

1.2.1 血液 于术前或体检当天收集2 mL空腹肘静脉血于EDTA抗凝管中，3 000×g离心10 min，将上层血浆转移至EP管中，以12 000×g离心15 min，取上层血浆300 μL用于相关指标的检测。

1.2.2 组织 将手术当天收集的组织标本用生理盐水冲洗干净，分为两份，一份立即置于-80 ℃冰箱中保存备用，另一份甲醛固定。

1.3 let-7a及HMGA2、Cyclin D1 mRNA的检测采用实时荧光定量PCR法检测血浆和组织中let-7a以及组织中HMGA2、Cyclin D1 mRNA的表达。Trizol总RNA提取试剂购自美国Invitrogen公司，Quant Script RT试剂盒、Real Master Mix购自日本TOYOBO公司。 let-7a特异性引物由上海吉玛制药技术有限公司设计合成，其余均由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列见表1。将离心后的血浆及液氮研磨后的组织标本采用Trizol法提取总RNA，反转录生成cDNA。PCR反应体系20 μL:cDNA 2 μL, 10 μmol/L上、下游引物各0.8 μL，1×SYBR®Green Real time PCR Master Mix 10 μL，蒸馏水6.4 μL。反应条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s(40个循环)。以U6为let-7a的内参，以GAPDH为HMGA2和Cyclin D1的内参。目的RNA表达水平以2-ΔΔCT计算。重复实验3次。

1.4 HMGA2、Cyclin D1蛋白的检测 采用免疫组化SP法检测，按照试剂盒说明书操作。SP试剂盒、DAB 显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，兔抗人HMGA2多克隆抗体、兔抗人Cyclin D1单克隆抗体为美国Abcam公司产品。染色完成后，于倒置显微镜下观察。胞核或胞质内出现棕黄色或棕褐色颗粒物为HMGA2、Cyclin D1蛋白阳性细胞。选取5个高倍视野(×400)，每个视野内计数100个细胞。按染色强度评分：棕褐色3分，棕黄色2分，淡黄色1分，无黄色颗粒0分；按阳性细胞百分比评分：0～为1分，25%～为2分，50%～为3分，75%～为4分。两项评分相乘，0～3分为阴性，3～6分为阳性。

表1 引物序列

1.5 统计学处理 采用SPSS 21.0进行统计学处理。对照和卵巢癌组let-7a及HMGA2、Cyclin D1 mRNA表达水平的比较采用两独立样本t检验或校正t检验。不同临床病理特征上皮性卵巢癌组织中let-7a表达水平的比较采用两独立样本t检验或单因素方差分析，HMGA2和Cyclin D1蛋白阳性表达率的比较采用χ2检验。采用Pearson相关分析评估组织中let-7a与HMGA2、Cyclin D1 mRNA表达的相关性。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 卵巢癌患者let-7a的表达情况

2.1.1 卵巢癌和对照组血浆和组织中let-7a表达水平的比较 见表2。卵巢癌组血浆和组织中let-7a表达水平均低于对照组，未发现卵巢癌患者血浆和组织中let-7a的表达有相关性(r=0.163,P=0.270)。以血浆let-7a表达水平诊断上皮性卵巢癌的ROC曲线见图1，结果显示，AUC(95%CI)=0.826(0.728～0.923)，提示血浆let-7a表达水平对上皮性卵巢癌有一定诊断价值。

2.1.2 不同临床病理特征的上皮性卵巢癌患者癌组织中let-7a表达的比较 见表3。FIGOⅢ、Ⅳ期，有淋巴结转移者血浆let-7a表达水平低于FIGOⅠ、Ⅱ期或无转移者。

表2 卵巢癌和对照组血浆和组织中let-7a表达水平的比较

*：对照组组织样本量为26，血浆样本量为23；#：校正t值。

图1 ROC曲线

表3 不同临床病理特征的上皮性卵巢癌患者癌组织中let-7a表达水平的比较

2.2 卵巢癌患者癌组织中HMGA2、Cyclin D1 mRNA及蛋白的表达

2.2.1 卵巢癌和对照组组织中HMGA2、Cyclin D1 mRNA及蛋白表达的比较 见图2、表4。卵巢癌组组织中HMGA2、Cyclin D1 mRNA及蛋白表达均高于对照组。

A:子宫内膜样癌组织中HMGA2蛋白阳性表达;B:正常卵巢上皮组织中HMGA2蛋白阴性表达；C:浆液性囊腺癌组织中Cyclin D1蛋白阳性表达;D:正常卵巢上皮组织中Cyclin D1蛋白阴性表达。图2 卵巢癌及正常卵巢上皮组织中HMGA2和Cyclin D1蛋白的表达(SP,×400)

表4 两组组织中HMGA2、Cyclin D1 mRNA及蛋白表达水平的比较

*:校正t值。

2.2.2 不同临床病理特征的上皮性卵巢癌患者癌组织中HMGA2、Cyclin D1蛋白表达的比较 见表5。癌组织中HMGA2和Cyclin D1蛋白的表达与上皮性卵巢癌的FIGO分期、淋巴结转移有关，而与患者年龄、分化程度及组织学类型均无关。

表5 不同临床病理特征的上皮性卵巢癌患者癌组织中HMGA2和Cyclin D1蛋白表达水平的比较

2.3 上皮性卵巢癌组织中let-7a与HMGA2、Cyclin D1 mRNA表达的相关性分析 Pearson相关分析结果显示，let-7a与HMGA2、Cyclin D1 mRNA表达均呈负相关(r=-0.729、-0.735,P<0.001)。

3 讨论

上皮性卵巢癌是一种高度异质性疾病，病因仍不明确，如何从分子层面揭示其发病机制、寻找潜在的肿瘤标志物和治疗靶点是目前研究的热点与难点。

研究[9-11]发现，let-7a在多种恶性肿瘤中呈低表达，如喉癌、外阴鳞状细胞癌、肝癌等，是一种潜在的抑癌基因。miRNA可在血液循环中稳定存在，有可能成作为潜在的肿瘤标志物。该研究结果提示，卵巢癌患者血浆let-7a表达水平明显低于正常，进一步建立以上皮性卵巢癌患者血浆let-7a表达水平诊断卵巢癌的ROC曲线，结果显示，AUC为0.826，提示血浆let-7a表达水平对卵巢癌有较高的诊断价值，可能成为卵巢癌的诊断标志物，与孟伟伟等[12]的报道一致。

HMGA2是一种非组蛋白染色体蛋白，参与转录、分化和胚胎发育等生理过程，同时还与许多人类肿瘤的发生发展密切相关。HMGA2与上皮间质转化(EMT)过程关系密切，参与多条EMT相关信号通路(如TGF-β/Smad3信号通路、Wnt/β-catenin信号通路等)，是EMT发生过程中的一个关键分子。Cyclin D1编码基因位于11q13，有5个外显子，全长约15 kb，作为公认的原癌基因，其过度表达可致细胞增殖失控而恶性化。HMGA2和Cyclin D1均为let-7a的靶基因[3,13-14]。该研究结果显示，let-7a在卵巢癌组织中的表达水平明显低于正常卵巢组织，而HMGA2和Cyclin D1表达水平明显高于正常卵巢组织，且三者表达均与FIGO分期、淋巴结转移有关；癌组织中Let-7a与HMGA2、Cyclin D1 mRNA表达呈负相关。推测let-7a可能协同靶基因参与了卵巢癌的发生发展。let-7a在肿瘤发生的早期缺失，类似于反向胚胎发育的过程[15]。Let-7a低水平表达可促进HMGA2的转录和翻译，HMGA2可能进一步通过TGF-β/Smad3或Wnt/β-catenin信号通路介导EMT，参与上皮性卵巢癌的侵袭与进展。Let-7a的缺失还可促进Cyclin D1表达升高，加速肿瘤细胞由G1期向S期转化，进一步激活PI3K/AKT通路，促进肿瘤生长。

综上所述，作者认为，血浆let-7a表达水平可以用于上皮性卵巢癌的辅助诊断；let-7a及其靶基因HMGA2和Cyclin D1参与了上皮性卵巢癌的发生发展。

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(2016-10-11收稿 责任编辑王 曼)

Expressions of let-7a and its target genes HMGA2,Cyclin D1 in epithelial ovarian cancer

LILi1),JIAHui1),LIBaoping1),LIXiaozhen1),SUNWei1),ZANGXinghui1),LIHongyu1),DUANZhenfeng2),GUOYuqi1,3)

1)DepartmentofGynecologyandObstetrics,theThirdAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)SarcomaBiologyLaboratory,MassachusettsGeneralHospital,HarvardUniversity,BostonMA02114 3)InternationalJointLaboratoryforGynecologicalOncologyNanomedicineofHenanProvince,Zhengzhou450003

epithelial ovarian carcinoma;let-7a;HMGA2;Cyclin D1

Aim: To detection the expressions of let-7a in plasma and tissue of the epithelial ovarian carcinoma(EOC) patients and to explore the clinical significance. Methods: The plasma and tissue samples of 48 patiens with EOC, the plasma samples of 23 healthy controls, and the tissue of 26 cases of normal ovarian(the control) were collected to detected the expressions of let-7a, HMGA2, and Cyclin D1 mRNA by qRT-PCR. The expressions of HMGA2 and Cyclin D1 protein in the tissue were detected using immunohistochemical SP method. Results: The expression level of let-7a in plasma and tissue of the EOC group was significantly lower compared with the controls(P<0.05).The expression level of let-7a in plasma had no correlation with that in tissue(r=0.163,P=0.270).AUCof ROC about the let-7a plasma level for EOC diagnosis was 0.826(95%CIwas 0.728-0.923).The expressions of HMGA2 and Cyclin D1 mRNA and protein were significantly higher in EOC tissue compared with the control (P<0.05).The expressions of let-7a,HMGA2 and Cyclin D1 in EOC tissue were significantly associated with the FIGO stage and lymph node metastasis(P<0.05).The expression of let-7a was negatively correlated with the mRNA level of HMGA2(r=-0.729,P<0.05) and that of Cyclin D1(r=-0.735,P<0.05).Conclusion: The plasma level of let-7a is valuable for the EOC diagnosis;let-7a with HMGA2 and Cyclin D1 may be involved in the occurrence and development of EOC.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.04.006

R725.4

*河南省高校科技创新团队项目 16IRTSTHN018；国家自然科学基金面上项目 81572574