斯氏按蚊性别决定基因fruitless的鉴定及其性别可变剪接分析

王衍海 王欣玲 顾金保

102206 北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 传染病预防控制国家重点实验室(王衍海、王欣玲)；510515 广州，南方医科大学公共卫生学院病原生物学系 广东普通高校新发传染病防治重点实验室(顾金保)

·论著·

斯氏按蚊性别决定基因fruitless的鉴定及其性别可变剪接分析

王衍海 王欣玲 顾金保

102206 北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 传染病预防控制国家重点实验室(王衍海、王欣玲)；510515 广州，南方医科大学公共卫生学院病原生物学系 广东普通高校新发传染病防治重点实验室(顾金保)

目的 分离、鉴定和分析斯氏按蚊性别决定基因fruitless(Anstfru)。方法 通过生物信息学方法与分子生物学方法获得了Anstfru基因的全长。通过RT-PCR方法验证Anstfru的性别可变剪接模式与时间表达特点。通过与已知物种FRU蛋白比较，分析斯氏按蚊FRU蛋白结构特点与分子进化特征。结果 分离并鉴定Anstfru基因全长，其在雌、雄蚊中通过可变剪切形成性别特异性mRNA。Anstfru在1～2龄阶段幼虫阶段开始表达，表达量随后逐渐升高，在成蚊中表达量最高。FRU蛋白具有保守的BTB与锌指功能结构域区。结论 Anstfru具有保守的昆虫性别决定基因fru表达特征与功能结构域，对其深入研究将为其最终应用于蚊虫雌雄分离技术，推动昆虫不育技术(Sterileinsecttechnique,SIT)在蚊媒传染病防治上的应用。

Fund programs: National Natural Science Foundation of China (81672054)

节肢动物的性别分化是由复杂的性别决定基因调控网络掌控的，其中不同种属的动物的顶端主开关基因(Master switch gene)差异很大，例如双翅目(Diptera)黑腹果蝇中(Drosophila melanogaster)，这个顶部的因素是果蝇X染色体的量[1]；在膜翅目(Hymenoptera)蜜蜂中是由补充性别决定基因(Complementary sex determiner, CSD)决定的[2]；而鳞翅目(Lepidoptera)家蚕(Bombyx mori)则是由雌性W染色体上feminizer(fem)基因编码的 piRNAs调控masculinizer (masc)来启动性别决定的[3]，而埃及伊蚊Aedes aegypti的性别则由雄性决定因子nix基因决定[4]。性别调控通路的中、底层的调控因子却较少变异。如，位于网络中心的双性基因doublesex(dsx)与主要在中枢神经系统表达的fruitlesss(fru)基因就在几乎所有的昆虫中被发现，dsx决定体细胞的性别并通过下游靶基因最终决定个体性表型[5]，而fru则调控雄性求偶等性行为[6]。蚊类fru基因在重要媒介冈比亚按蚊与埃及伊蚊中已有报导[7,8]，其具有典型的性别特异性可变剪接，在雌雄蚊中分别转录不同的转录本fruM与fruF。斯氏按蚊(Anophelesstephensi)是南亚次大陆直到中东很多地区的重要疟疾媒介，在我国海南、 广西、云南等地区亦有分布。我们将对斯氏按蚊的fru进行鉴定与可变剪切分析。

1 材料与方法

1.1 蚊株与饲养 斯氏按蚊AsteS1株为弗吉尼亚理工学院暨州立大学生物化学系保种。成蚊饲养于27～29 ℃，60%～80%湿度，12 h/d光照循环环境。成蚊饲10%蔗糖水。幼虫饲养于27 ℃脱氯自来水，喂食酵母粉、兔肝粉2: 1混合饲料。

1.2Anstfru的克隆策略 以埃及伊蚊fru基因(GenBank: JX186753)为查询序列，对斯氏按蚊基因组与转录组(https://www.vectorbase.org)行TBLASTX同源性比对(参数：E-value <1e-10)。

1.3 RNA的提取与cDNA第一链合成 分别采集0～4 h新产蚊卵、1～2龄幼虫、3～4龄幼虫、蛹、羽化后2 d未交配雌雄成蚊。各阶段均为100个个体混合，使用TRIzol Reagent(美国Invitrogen公司)提取不同发育阶段样品总RNA，以DNase I(美国Ambion公司)移除RNA样品中的DNA残留，方法参考试剂盒说明书。使用RevertAid first strand cDNA Synthesis 试剂盒(美国Thermo scientific公司)以单链RNA为模板合成cDNA第一链，产物保存于-80°C。

1.4 全长Anstfru的获得 分别设计5对引物AnstfruF1-5与 AnstfruR1-5，引物序列为F1：CGGCACTTCCACTGTACGC，R1：CCATTGCTCCAACTACGG，F2：TCATCGACAAGAACTGTGCAT，R2：TGTTCTCGACGAATATCTGCT，F3：AGTCTAATTTAACCACCGTGCTCA，R3：GCTCACCTTAAACTCGTCGT，F4：CCCGGAACCTTCTTATCGTTG，R4：CGACTGCCCATCAATATTGTCT， F5:TACGAGCATCACTTGTCACGG， R5:CTTGCAGTTCAGGGGATTGCTAA，以cDNA为模板进行RCR反应，获得编码区序列全长。选用SMARTer RACE cDNA Amplification试剂盒(美国CLontech公司)，通过3′与5′ RACE获得基因两端非编码区全长，引物设计按照试剂盒说明设计要求。以上反应循环参数参考文献[7]。PCR产物克隆入pGEM-T Easy Vector载体，由华大基因生物科技(深圳)有限公司完成测序。

1.5Anstfru基因表达谱 以雄性特异引物Mspecific：ATCATTACGCAGGAACAGC，雌性特异引物F4分别为上游引物，以R4为下游引物扩增不同发育阶段斯氏按蚊cDNA。以斯氏按蚊核糖体蛋白S4基因AstRps4 (EU883624)为内参照，引物序列与循环参数参照文献[9]。引物由广州英伟创津公司合成。

1.6 基因进化分析 用Clustal X 1.81进行多重氨基酸序列比对(默认参数值)。选取不同种类昆虫FRU蛋白同系物的BTB (Broad-complex, Tramtrack and Bric-a-brac)区域氨基酸序列来建立进化树。以ClustalW2.1行核苷酸序列多重比对后，利用MEGA4 package软件以NJ法(Neighbor-joining)进行分子系统进化树分析，1000次Bootstrap检测。

2 结果

2.1Anstfru的鉴定与分子结构特点 以Aaefru为查询序列通过vectorbase数据库比对，在斯氏按蚊EST数据库找到同系物候选基因(e<1e-10)，共寻找到三个转录本ASTE01166、 ASTE011664、ASTE011062。

使用PCR与RACE方法对Anstfru全序列进行克隆，分别获得雄性成蚊AnstfruM与雌性成蚊AnstfruF和cDNA序列全长。通过与基因组序列比对，AnstfruF全长4 251 nt，mRNA组由10个外显子构成，其中第2、3外显子为雌性特异性外显子，起始密码子位于第4外显子，终止密码子位于第10外显子，编码长度为572 aa的雌性特异性蛋白FRUF。AnstfruM基因mRNA组由8个外显子构成，长度为2 143nt，编码长度为630 aa的雄性特异性蛋白FRUM(图1)。

注：矩形为外显子区，外显子与内含子未按实际长度比例绘制图1 Anstfru基因结构Note: Exons are shown as boxes. Exons and Introns are not shown in actual scaleFig.1 Exon/intron organization of Anstfru

2.2Anstfru的表达特点 RT-PCR法检测雄蚊与未交配雌蚊fru可变剪切情况，结果如图2显示：Anstfru基因在雌、雄成蚊内有不同大小的转录产物，经测序验证在雌性体内具有雌性特异性外显子。同时我们检测了AnstfruM，AnstfruF时间表达谱，结果显示：无论雌雄fru均在1～2龄幼虫开始表达，表达量逐渐增加，在成蚊中表达量至最高，证实fru主要在成蚊中发挥功能。

E1： 0～12 h 卵； E2∶12～24 h卵；L1-2∶1～2龄幼虫；L3-4： 3～4龄幼虫；P： 蛹; A：成蚊；♂：雄性成蚊♀：雌性成蚊；M：1kb DNA ladder。斯氏按蚊核糖体蛋白S4基因AstRps4为内参照。卵、幼虫、蛹、成蚊样品均为雌雄混合样品图2 Anstfru基因的表达分析The analyses were performed on the following samples: E1=0～12 h embryos; E2=12～24 h embryos; L1-2=1st～2nd larvae; L3-4=3rd～4th larvae; P=pupae; A=adult;♂=adult males; ♀=adult female; M：1kb DNA ladder. An.stephensi Rps4 gene was used as a control. Except for ♂and♀, all samples are composed of mixed sexesFig.2 Developmental expression analyses of the Anstfru gene

2.3Anstfru的结构域分析 雌、雄FRU蛋白均包含一个序列保守的BTB (Broad-complex, Tramtrack and Bric-a-brac)结构域，主要作为二聚化接口；C末端含C2H2锌指结构域，主要为DNA结合功能。 还具有N末端延伸区(N-Terminal Extension)与连接子区(Connector)，该区域序列物种间差异较大。同时在雌性AnstfruF发现4个TRASFORM/TRFORM-2-蛋白结合位点。

2.4Anstfru分子进化树特点 由于昆虫FRU蛋白BTB结构域相对保守，将不同种类昆虫的编码BTB区氨基酸的核苷酸序列进行分子进化分析。图4显示，埃及伊蚊、冈比亚按蚊与所有双翅目昆虫聚在一个亚支内，其中蚊科聚为一支，其它双翅目成员形成另外一个小分支。FRU蛋白的分子进化特点与另一性别决定蛋白DSX进化树形态极相似。

3 讨论

图3 FRU蛋白部分氨基酸的多重序列比对Fig.3 Multiple sequence alignment of partial FRU homologues from An.stephensi, D. melanogaster, Ae.aegypti and An. gambiae

注：进化树分析基于不同种类昆虫FRU蛋白BTB 结构域氨基酸序列图4 FRU蛋白BTB 结构域核苷酸序列的分子进化分析Note: A phylogenetic tree based on the combined FRU nucleotide sequences encoding BTB domains in different insect speciesFig.4 Phylogenetic and molecular evolutionary analyses based on the nucleotide sequences of FRU BTB domains

本研究对疟蚊-斯氏按蚊的行为调控基因Anstfru进行了克隆与分析，结果显示Anstfru具有典型的雌雄特异性转录本，通过可变剪切在雌、雄蚊中分别转录为雌雄特异性的AnstfruF和AnstfruM，与报道的蚊类中的埃及伊蚊、冈比亚按蚊以及其它双翅目、鳞翅目、鞘翅目、膜翅目的昆虫fru相似均具有性别可变剪切模式[9]，这证明fru基因在昆虫性别决定调控网络中与dsx非常相似，处于调控网络的中下游，而且其作用亦相对保守。RT-PCR结果显示，AnstfruF和AnstfruM表达模式非常相似，在胚胎阶段均无表达，均在1～2龄幼虫开始出现低表达，直到成蚊才开始高表达，这也可以解释fru主要调控成蚊的性相关行为。斯氏按蚊的FRU蛋白中具有保守的BTB结构域，其广泛存在于从酵母到人类的各种物种中，在进化上属高度保守的结构域，约含有115个氨基酸[10]。BTB属转录调控因子，对下游基因既可转录激活又可抑制[10]，也间接证明蚊虫的FRU可能与其它昆虫的FRU具相同的作用，调控下游多种与雄性求偶等有关的多种性行为基因。虫不育技术(Sterile insect technique，SIT)是利用遗传学的方法向外界释放大量不育的雄性害虫，通过与野生雄性竞争从而达到抑制害虫种群数量的目的。雌性蚊虫是骚扰、吸血、传病的主角，因此向野外释放的必须是大规模的不育或转基因雄蚊，若释放少量雌性必将带来相反的后果，目前常用的蚊虫雌性机械分离方法很难满足这种要求，尽管改良法分离的雄性百分比能达到97%～99%[11]，但是若考虑到百万级的模释规模，释放出的雌蚊数目依然不可忽视。对fru基因的深入研究，可利用转基因方法对性别决定基因加以调控，使雌性蚊虫死亡或雄性化，从而丧失吸血能力，达到控制蚊媒的目的，对蚊媒控制具有重要的意义。

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(本文编辑：吕新军)

IsolationandexpressionprofilingoffruitlessgeneinAnopheles stephensi

WangYanhai,WangXinling,GuJinbao

StateKeyLaboratoryforInfectiousDiseasePreventionandControl，NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China(WangYH,WangXL);KeyLaboratoryofPreventionandControlforEmergingInfectiousDiseasesofGuangdongHigherInstitutes,DepartmentofPathogenBiology,SchoolofPublicHealth,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China(GuJB)

GuJinbao,Email:gujinbao@fimmu.com

Objective To isolate, identify and analyze the sex-determining genefruitless(Anstfru)of malaria-transmitting mosquitoAnophelesstephensi. Methods The full length cDNA of the geneAnstfruwas obtained by using bioinformatic and molecular biological method . RT-PCRmethod was used to validate the sex variable splicing pattern and expression time characteristics. The structural features and molecular evolutional features of FRU protein ofAnophelesstephensiwere analyzed via comparison with FRU protein of known species. Results The full length ofAnstfrugene was isolated and identified, and sex-specific mRNA of the gene could form in female and male mosquitos through variable splicing. TheAnstfrubegan to be expressed from early 1st-2ndstage larvae embryo, the quantity of expression increased subsequently and displayed the highest expression level in adult stage. The FRU protein had the sequence-conservative BTB and zinc finger functional domains. ConclusionsAnstfrugene showed conservative functional domains and sex-determining genefruexpression features in mosquito and further in-depth studies on which will facilitate the application of techniques separating female mosquitos from male mosquitoes, and sterile insect technique (SIT)/technology in prevention and treatment of mosquito-borne infectious diseases.

Anophelesstephensi;Fruitless; Sex-determining gene; Sex-specific alternative splicing

顾金保，Email: gujinbao@fimmu.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.03.014

斯氏按蚊；Fruitless；性别决定基因；性别可变剪接分析

国家自然科学基金(81672054)

2017-05-07)