我国沈阳一起GII.17型诺如病毒胃肠炎暴发的分子病原学特征研究

王冰 张春青 王萍 张眉眉 连志勇

110031 沈阳市疾病预防控制中心(王冰、张春青、王萍、连志勇)；110005 沈阳，辽宁省疾病预防控制中心(张眉眉)

·论著·

我国沈阳一起GII.17型诺如病毒胃肠炎暴发的分子病原学特征研究

王冰 张春青 王萍 张眉眉 连志勇

110031 沈阳市疾病预防控制中心(王冰、张春青、王萍、连志勇)；110005 沈阳，辽宁省疾病预防控制中心(张眉眉)

目的 明确沈阳地区一起学校急性胃肠炎暴发的病原和基因特征。方法 采集2015年12月沈阳地区某高校暴发疫情中的学生和食堂从业人员病例肛拭子标本共计15份，采用荧光定量RT-PCR进行诺如病毒检测，并对阳性标本进一步进行传统RT-PCR方法扩增、序列测定和系统进化分析。结果 荧光定量RT-PCR检测确定12份标本为诺如病毒阳性，系统进化分析表明，12个毒株均为GII.17基因型，与引起我国2014—2015年流行的GII.17新变异株KR020503株同源性为99%以上。结论 引起我国2014—2015年流行的GII.17新变异株是引起此高校急性胃肠炎暴发的病原，并且GII.17型诺如病毒为东北地区首次检出。

Fund programs: National Science and Technology Major Project of China(2012ZX10004209)

诺如病毒(Norovirus,NoV)属于杯状病毒科诺如病毒属，目前被认为是引起全球冬季急性胃肠炎暴发的最主要病原[1]。NoV为单股正链无包膜RNA病毒，基因组约为7.5 Kb，共有三个开放阅读框(Open reading frams, ORFs)，根据ORF1编码的RNA聚合酶区(RNA dependent RNA polymerase, RdRp)和ORF2编码的衣壳蛋白区(Capsid)核苷酸序列差异，将NoV分为5个基因组(GI-GV)，其中GI、GII、GIV可感染人类，又以GII型多见[2]。自1995年以来，GII.4基因型一直是NoV引起全球暴发流行的优势株，我国从2006年开始建立病毒性腹泻监测网络，监测结果显示我国NoV引起的胃肠炎暴发型别多以GII.4/2006b变异株为主(占88.2%)[3]，这与其他国家报道基本一致。但在2014—2015年冬春季节，我国出现新的GII.17变异株引起的NoV暴发激增，并在日本同期引起流行，欧洲及美国也有GII.17新变异株引起暴发的报道。迄今为止，在我国东北地区由GII.17引起的急性胃肠炎暴发鲜有报道，本研究对我市2015年12月暴发的一起学校聚集性急性胃肠炎疫情进行病原学分子分型鉴定和遗传进化分析，为以后此类疾病监测和疫情处置提供客观的参考依据。

1 材料与方法

1.1 标本收集 取自2015年12月沈阳市某高校腹泻疫情中的15个胃肠炎患者，均为肛拭子(粪便)标本，其中在校学生10份，食堂从业人员5份。

1.2 标本前处理 取腹泻标本约0.1 g，加入分装好0.9 ml PBS的1.5 ml Eppendorf管中。振荡混匀，制备10%的便悬液， 5 000 rpm离心5 min，使用澄清的上清液进行RNA提取。

1.3 核酸提取 取便悬液上清200 μl，采用德国Qiagen公司RNeasy Mini Kit试剂(Cat:74104)在QIA Cube核酸提取仪上对标本进行RNA的提取，最终RNA体积为50 μl。

1.4 荧光定量RT-PCR(Real-Time RT-PCR)检测 采用NoV通用核酸荧光定量检测试剂盒和GI/GII双通道荧光定量检测试剂盒(江苏硕世生物科技有限公司)，在ABI 7500荧光定量PCR仪上进行检测，反应体系、扩增条件和结果判读均按照试剂盒说明书进行。

1.5 Capsid与RdRp区的扩增和序列测定 采用传统RT-PCR方法，将1.4鉴定为阳性的核酸毒株进行扩增，选用德国Qiagen公司的One step RT-PCR Kit试剂(Cat:210212)，在ABI公司的veriti PCR仪上进行扩增，反应体系、扩增参数和引物序列参见文献[4]，扩增阳性产物送TaKaRa公司进行纯化后双向测序。

1.6 序列拼接和进化分析 应用Lasergene7.1软件对序列进行拼接，从GenBank下载相关NoV的核酸序列片段，利用MEGA6.0软件与本研究完成测序的序列进行比对，应用Neighbor-Joining(N-J)法构建进化树。

2 结果

2.1 疫情概况和特征 疫情所在高校共有2万余学生，共报告病例58例。男性23人，女性35人；学生为35人，食堂从业人员为23人，其中学生分散在不同班级和宿舍，呈散在分布无明显的聚集性，但发病前具有同一暴露源就餐地点。发病日期集中，首发病例为2015年11月28日，末例病例为12月3日，发病高峰为12月2日。临床症状基本相似，症状轻、病程短，主要以恶心(89.7%)、呕吐(75.9%)和腹泻(65.5%)为主，多数成水样便和稀便，实验室血常规检测显示90%以上患者白细胞数和中性粒细胞分属为正常范围内。

2.2 Real-Time RT-PCR检测 共检测15份标本(学生10份、食堂从业人员5份)，检出NoV核酸通用阳性12份，进一步鉴定均为NoV GII型，阳性率为80%(12/15)，其中在校学生阳性9份(SY-1～SY-4、SY-6～SY-10)，食堂从业人员3份(SY-11～SY-13)。

2.3 RT-PCR扩增和序列测定 Real-Time RT-PCR检出的阳性标本核酸，用传统RT-PCR方法对RdRp区和capsid区进行扩增，12份样本在两区域均成功扩增，PCR产物与预计片段大小相符。

2.4 NoV RdRp区序列测定及系统进化分析 RdRp区系统进化树显示，本研究测得的12株NoV毒株均分布在GII-17亚型分支上，其RdRp区同源性为100%。与2014年广州株KR020503、2014年香港株KP998539同属一个进化分支，亲源性较近，同源性分别为99.7%、97.8%。而与2013年日本株LC043167虽然同属于GII-17亚型分支，但亲源性较远，同源性仅为77.1%。

◆: 表示学生；◇: 表示食堂员工图1 NoV的RdRp区核苷酸序列进化分析◆: represents student；◇: represents kitchen staffFig.1 Phylogenetic tree based on partial RdRp gene sequences from genotype GII NoV strains in Shenyang

2.5 NoV capsid区序列测定及系统进化分析 capsid区系统进化树显示，本研究测得的12株NoV毒株均分布在GII-17亚型分支上，其capsid区同源性均为100%。与2014年广州株KR020503、2015年日本株LC037415同属一个GII.17亚型进化分支，亲源较近，同源性分别为99.6%、99.2%；与2009年瑞士株GQ266697，虽然同为GII.17型，但亲源性较远，同源性仅为81.9%。

◆: 表示学生；◇: 表示食堂员工图2 NoV的capsid区核苷酸序列进化分析◆: represents student；◇: represents kitchen staffFig.2 Phylogenetic tree based on partial capsid gene sequence from genotype GII NoV strains in Shenyang

3 讨论

以往十几年监测显示，全球约有20%的急性胃肠炎是由NoV感染引起的，由于高度传染性、感染剂量低和变异性强等特点，导致该病毒能在相对封闭的环境中迅速传播，带来巨大的疾病负担和社会恐慌。NoV通过突变和同源重组两个分子机制发生变异，使其基因型和抗原性具有丰富的动态多样性，导致不同时间和空间上的优势流行株存在着较大差异。近些年我国监测结果显示，其暴发和流行多以GII.4/2006b相似株为主，还有报道GII.2型和GII.3型引起的暴发疫情[5-6]，而GII.17型报道较少。本研究在2015年12月，沈阳市某高校暴发疫情中检测出NoV基因型为GII.17型，是东北地区首次在急性胃肠炎暴发疫情中检测到该基因型毒株。

流行病学调查显示，该事件发病时间分布符合同源暴露的点源暴发疫情，所有患病学生和食堂从业人员均在一个最长潜伏期内，发病前具有同一暴露源就餐地点，相关部门采取控制措施停止供餐后，病例消失。采集患者标本，应用Real-Time RT-PCR方法，实验室检测出NoV核酸阳性，并进一步判断为GII.17基因型，且同源性为100%，证实为诺如病毒感染引起的急性胃肠炎疫情，通过对病例临床症状和流行病学资料综合分析，确认该起为传播途径明确的食源性感染性腹泻突发公共卫生事件，对该起暴发事件的定性和处置提供了科学的依据。

GII.17型NoV为1978年首次在美国发现，之后消失数年，直到2005年在东非地区的肯尼亚地表水中再次检测到该型别毒株，通过进化分析确定为GII.17亚型；2014年前后在东亚和东南亚地区相继发现新的GII.17型变异株。从图2的Capsid区系统进化树大致可以看出，NoV的GII.17型在Capsid区通过累积突变和基因重组使其一直处于不断变异过程中，由于抗原的变化使得毒株针对宿主造成免疫逃逸，出现新的流行株。特别是2002年后，大概每隔2～3年就会出现较大变异，其Capsid区的氨基酸有2.0%左右的差异，我国在2014年先后在江苏南京市和广东广州市两起暴发疫情中检测到GII.17型毒株，监测数据表明2014—2015年GII.17型变异株遍及我国11个省市[7]，已具有取代GII.4/2006b变异株成为新流行优势株的趋势。本次暴发疫情发现的毒株与2014年广州株KR020503相比，其RdRp区和Capsid区的核苷酸同源性分别为99.7%和99.6%，毒株间亲缘性很近，表明该毒株由南向北已有进一步蔓延流行的趋势。

本研究表明GII.17型NoV毒株已经在东北地区出现，以往该地区人群普遍缺乏对其免疫力，并未构成有效的免疫屏障，所以应作为监测的重点毒株引起相关医疗机构和行政部门的重视。但由于东北地区以往对该毒株未引起足够重视，进而缺少相关的监测资料，还需尽快建立常规诺如病毒监测系统加以动态观察。因此加强对NoV感染情况的监测和分子病原学研究已迫在眉睫，尽快健全我国诺如病毒监测网络体系的建设具有十分重要的战略意义。

[1] Noel JS, Fankhauser RL, Ando T, et al. Identification of a distinct common strain of “Norwalk-like viruses” having a global distribution[J]. J Infect Dis, 1999, 179:1334-1344. doi: 10.1086/ 314783.

[2] Zheng DP, Ando T, Fankhauser RL, et al. Norovirus classification and proposed strain nomenclature[J]. Virology, 2006, 346:312-323. doi: 10.1016/j.virol.2005.11.015.

[3] 靳森, 孙军玲, 常昭瑞, 等. 中国2006-2007年诺如病毒胃肠炎暴发及其病原学特征分析[J]. 中华流行病学杂志, 2010,31(5):549-553. doi: 10.3760/cma.j.issn.0254-6450.2010.05.017.

[4] Motomura K, Oka T, Tokoyama M, et al. Identification of monomorphic and divergent haplotypes in the 2006-2007 norovirus gii/4 epidemic population by genomewide tracing of evolutionary history[J]. J Virol, 2008, 82(22):11247-11262. doi: 10.1128/JVI.00897-08.

[5] 付建光, 艾静, 靳淼, 等. 江苏省近期急性胃肠炎暴发中诺如病毒分子特征分析[J]. 中华流行病学杂志, 2013, 34:808-811. doi: 10.3760/cma.j.issn.0254-6450.2013.08.013.

[6] 史永林, 孔翔羽, 靳淼, 等. 安徽省诺如病毒胃肠炎暴发的分子病原学特征研究[J]. 中华实验和临床病毒学杂志, 2015, 29:310-312. doi: 10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2015.04.007.

[7] Jin M, Zhou YK, Xie HP, et al. Characterization of the new GII.17 norovirus variant that emerged recently as the predominant strain in China[J]. J Gen Virol, 2016, 97(10):2620-2632. doi: 10.1099/jgv.0.000582.

(本文编辑：吕新军)

The molecularly etiological study on the GII.17 norovirus causing an acute gastroenteritis outbreak in Shenyang

Wang Bing, Zhang Chunqing, Wang Ping, Zhang Meimei, Lian Zhiyong.

Shenyang Center for Disease Control and Prevention, Shenyang 110031,China(Wang B, Zhang CQ, Wang P, Lian ZY); Liaoning Center for Disease Control and Prevention, Shenyang 110005, China(Zhang MM)

Wang Bing, Email: cdcwangbing@hotmail.com

Objective To define the etiology and genetics of the pathogen causing an acute gastroenteritis outbreak in a college of Shenyang. Methods A total of 15 anal swab samples were collected from students or kitchen staffs of the college where outbroke the epidemic of acute gastroenteritis in December 2015 in Shenyang, Liaoning province. Real-time PCR was performed to identify the infection of Norovirus(NoV). The NoV genes were amplified and sequenced for those positive samples, followed to perform phylogenetic analysis. Results Of the 15 specimens, 12 were NoV positive by Real-time PCR,phylogenetic analysis showed that the infected virus of the outbreak was belonged to NoV genotype GII.17. The homology between the present virus and new mutated GII.17 strain of KR020503 identified in 2014—2015 epidemic outbreak in China was over 99%. Conclusions The new mutated NoV GII.17 caused the acute gastroenteritis outbreak in a college of Shenyang in 2015,NoV GII.17 was detected firstly in Northeast China.

Norovirus; Acute gastroenteritis; Outbreak; GII.17 genotype

王冰，Email: cdcwangbing@hotmail.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.03.006

诺如病毒；急性胃肠炎；暴发；GII.17型

国家科技重大专项(2012ZX10004209)

2017-03-03)