经NAs治疗显效慢乙肝患者PBMC中HBX基因检测及临床意义

宋亦然 李鸽 张航 王洁 蒋艳明 康艳华 高依丹 张彬彬 陈公英

310053 杭州，浙江中医药大学(宋亦然)；310053 杭州师范大学附属医院(李鸽、王洁、蒋艳明、陈公英)；310053 杭州师范大学(张航、康艳华、高依丹、张彬彬、陈公英)

·病毒病诊断与治疗·

经NAs治疗显效慢乙肝患者PBMC中HBX基因检测及临床意义

宋亦然 李鸽 张航 王洁 蒋艳明 康艳华 高依丹 张彬彬 陈公英

310053 杭州，浙江中医药大学(宋亦然)；310053 杭州师范大学附属医院(李鸽、王洁、蒋艳明、陈公英)；310053 杭州师范大学(张航、康艳华、高依丹、张彬彬、陈公英)

目的 检测分析核苷(酸)类似物(Nucleoside analogues, NAs)治疗后血清HBV DNA阴转的慢乙肝(Chronic hepatitis B, CHB)患者外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)中HBX基因，研究其临床意义。方法 对60例经抗病毒治疗后血清HBV DNA阴转的慢乙肝患者，其中有部分病情进展为乙肝后肝硬化(HBV-related liver cirrhosis)及肝细胞性肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)，采用实时荧光定量PCR检测其PBMC中HBX基因，并分析其序列特点及临床意义。结果 60例患者中PBMC样品检测出HBX基因片段的有37例，检出率61.67%(37/60)；三组人群中，HCC、乙肝后肝硬化患者PBMC中HBX基因检出率明显高于CHB患者(P=0.000,P=0.010)；通过直接测序法，在2例HCC患者及1例CHB患者中，检测到HBX蛋白突变体蛋白HBX△120、HBX△129、HBX△131截短体；发现A389T/G391A、T380C两个热点突变，且HCC患者中A389T/G391A突变发生率明显高于CHB患者(P=0.021)；对于HBeAg(-)的肝硬化、HCC患者，T380C突变发生率高于HBeAg(+)患者(P=0.035)。结论 经NAs治疗后血清HBV DNA阴转的患者中，肝硬化、HCC患者的PBMC有更高的HBX检出率；HCC患者A389T/G391A双突变发生率高于CHB患者；HBeAg(-)的肝硬化、HCC患者T380C突变发生率高于HBeAg(+)患者。

Fund programs: Zhejiang Science and Technology Agency(2014C37081); Science and Technology Bureau of Hangzhou(20120533Q09)

在我国肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)的发生与慢性HBV感染密切相关，其机制迄今尚未充分阐明。研究发现，HBV感染所致HCC患者的血清中存在着高频自发的HBX突变体，可在癌组织中高表达[1]，提示HBX基因突变可能是HBV感染所致HCC发生的机制之一。此外，Zhang等在检测外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)内preS/S基因变异时发现，PBMC中能检测到HBV RNA和HBV cccDNA，可间接反映肝细胞内HBV DNA的存在[2,3]，是对血清HBX基因检测的重要补充。相关文献报道HBV整合入宿主细胞过程中，HBX的整合是最关键的一步，HBV相关的HCC患者中定期检查发现HBX检出率最高，表明HBX在HCC过程中发挥重要作用[4]。HBX基因频繁整合于宿主基因组，引起染色体的不稳定性缺失和插入突变的发生，导致HBX截短体的出现，对其反式激活功能发生影响[5,6]，表明HBX基因的突变与HCC的发生密切相关[7]。因此，本研究检测临床上经NAs治疗后血清HBV DNA阴转的慢乙肝(Chronic hepatitis B, CHB)、乙肝后肝硬化及HCC患者PBMC中HBX基因突变易发位点，分析3组患者的突变特点及临床意义，对CHB的进展及预后提供早期预警指标。

1 材料与方法

1.1 研究对象 本研究共收集2015年2月至2015年8月于杭州师范大学附属医院住院的CHB、乙肝后肝硬化及HCC患者全血共60份，诊断标准符合中华医学会肝病学分会、感染病学分会2011 年修订的《慢性乙型肝炎防治指南》(更新版)。患者入院后进行血常规、血液生物化学指标、病毒学指标、肝胆脾B超检查。排除合并其他肝炎病毒感染、其他类型肝硬化等患者。

1.2 试剂与仪器 Super real premix(SYBR Green) 荧光定量预混试剂、DH5α化学感受态细胞、TBE电泳缓冲液、DNA green核酸染料、Marker购自北京天根生化科技有限公司；淋巴细胞分离液购自天津市灏洋生物有限公司；AxyPreP基因组DNA小量抽提试剂盒、AxyPreP DNA凝胶回收试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；E.Z.N.A.TM质粒小提试剂盒购自美国Omega公司；PMD18-T载体购自大连宝生物工程有限公司；ABI 7500荧光定量PCR仪购自美国Applied Biosystem公司。

1.3 PBMC的分离及HBV DNA的提取 使用淋巴细胞分离液参照操作说明书对全血中的PBMC进行提取；使用AxyPreP基因组DNA小量抽提试剂盒参照说明书对PBMC中的HBV DNA进行提取。

1.4 SYBR Green荧光定量PCR 在GenBank中查取HBX基因序列，以HBX基因第382～401个碱基两侧相对保守区域设计引物和探针，正向引物序列为5′-cagcaatgtcaacgaccgacc-3′，反向引物序列为5′-aagttgcatggtgctggtg-3′，预期扩增产物148 bp，探针为FAM-agtacaaagacctttaaccta-MGB(序列方向5′→3′)。荧光定量PCR反应体系(20 μl)：2×Super Real Premix Plus 10 μl、正向引物(10 μmol/L)0.6 μl、反向引物(10 μmol/L)0.6 μl、DNA模板1 μl、50×ROX Reference Dye 0.4 μl、Rnase-free ddH2O 7.4 μl。实时荧光定量PCR反应条件为: 50 ℃ 2 min，95 ℃ 15 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 32 s，40个循环；95℃15 s，60℃1 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s。

1.5 质粒的构建及鉴定 将PCR反应扩增产物20 μl经2.5%琼脂糖凝胶电泳30 min，筛选出含有目的片段的标本，切胶回收后，连接到PMD18-T载体，连接质粒转化DH5α大肠埃希菌，经氨苄青霉素LB固体培养基筛选单克隆菌株，并通过LB液体培养基摇菌扩增，每一份血清样品选取5个质粒，回收质粒送上海生工生物工程有限公司测序。

1.6 目的DNA序列分析、对比 将测序结果(均测定优势序列)通过Chormas软件及NCBI blast对比分析，以目前国内公认B、C基因型HBX基因序列为参照序列，找出含有382～401碱基发生突变的结果，并分析其蛋白氨基酸突变模式。

1.7 统计学方法 使用SPSS16.0软件，计数资料采用χ2检验及Fisher精确概率法，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PBMC中目的HBX基因片段检出情况 60例患者的PBMC样品通过荧光定量PCR检测后，检出HBX基因片段的37例，检出率61.67%；其中CHB患者检出率26.32%(5/19)；乙肝后肝硬化患者检出率71.43%(15/21)；HCC患者检出率85%(17/20)。3组人群中HCC、乙肝后肝硬化患者PBMC中HBX基因检出率明显高于CHB患者(P=0.000, χ2=13.646;P=0.010, χ2=8.120)。见表1(卡方检验)。

表1 CHB、肝硬化、HCC患者PBMC中HBX基因检出情况

表3 HBX基因热点突变发生率

2.2 HBX基因突变情况 断裂的HBX基因连接在细胞DNA上，转录成融合的蛋白称为HBX蛋白截短体。本研究在2例HCC及1例CHB发现HBX截短体突变HBX△120、HBX△129、HBX△131，分别表示羧基末端第120、129、131个氨基酸截短体，见表2。

2.3 HBX基因热点突变情况 经测序发现两个热点突变：A389T/G391A双突变点及T380C点突变，其中在乙肝后肝硬化和HCC患者中A389T/ G391A双突变发生率为73.33%、82.35%，T380C点突变发生率33.33%、35.29%。其中HCC患者的A389T/G391A双突变发生率明显高于CHB患者(P=0.021)，差异具有统计学意义；而肝硬化组与CHB组的A389T/G391A双突变发生率相比较差异无统计学意义(P=0.109)。肝硬化和HCC组的T380C突变发生率与CHB组比较，差异无统计学意义(P=0.266，P=0.0.266)。见表3(卡方检验、单个频数小于5时采用Fisher精确概率检验)。

表2 不同位点的突变情况

2.4 HBX基因热点突变与HBeAg关系 32例检出HBX基因的肝硬化、HCC患者中，HBeAg(+) 14例，HBeAg(-) 18例；HBeAg(-)和HBeAg(+)患者A389T/G391A双突变发生率分别为88.89%、64.28%，差异无统计学意义(P=0.095，χ2=2.789)；HBeAg(-)和HBeAg(+)患者T380C突变发生率分别为50.00%、14.28%，差异具有统计学意义(P=0.035，χ2=4.453)。见表4(卡方检验)。

3 讨论

研究发现PBMC内 HBV DNA与血清HBV相关，抗HBV治疗过程中，PBMC内HBV DNA下降缓慢[8]。本次实验3组人群中HCC、乙肝后肝硬化患者PBMC内HBX基因检出率明显高于CHB患者。另外随着CHB进展为肝硬化、HCC，患者血清内HBV DNA阴性而PBMC内HBV DNA阳性所占比例显著上升，推测由于HBV长期存在，HBV DNA可能发生整合，下一步需检测PBMC中HBV DNA的存在形式。

表4 32例患者热点突变与HBeAg关系

通过测序发现A389T/G391A、T380C两个热点突变，前者在HCC患者中的突变率明显高于CHB患者；同时HBeAg(-)患者的T380C突变率高于HBeAg(+)患者。A389T/G391A双突变点位于HBV的基本核心启动子(Basic core promoter,BCP)区，该突变的发生会影响到该蛋白的功能，同时通过影响BCP区的功能降低前C区mRNA的转录，抑制HBeAg的合成引起肝细胞损伤。本研究发现A389T/G391A双突变在HCC患者中发生率最高，因此，检测A389T/G391A双突变对判断病情进展和预防HCC具有重要意义。另一方面，T380C点突变可能通过抑制前C mRNA转录活性，导致HBeAg的下调或不表达，表现为HBeAg(-)。

本实验在2例HCC及1例CHB患者的HBX基因中检测到HBX△120、HBX△129、HBX△131截短体存在。而相关研究发现，全长的HBX蛋白对细胞转化可能起着负调控作用，羧基端的缺失可能使其在调节细胞增殖、生存和转化方面出现了紊乱。HBX突变体尤其是C 端截短型的突变体可能是HBX引起HCC发生的重要机理。因此， CHB或肝硬化患者HBX基因发生羧基端的缺失，可能是发展为HCC的高危患者，值得以后进一步随访。此外，本文所进行的研究样本量偏小，检测序列片段较短，在后续研究中将加以完善。

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(本文编辑：吕新军)

Analysis of HBX gene in PBMC from chronic hepatitis B patients with undetectable serum HBV DNA after treatment by nucleoside analogues

Song Yiran, Li Ge, Zhang Hang, Wang Jie, Jiang Yanming, Kang Yanhua, Gao Yidan, Zhang Binbin, Chen Gongying

Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China(Song YR); The Affiliated Hospital of Hangzhou Normal University, Hangzhou 310053, China(Li G, Wang J, Jiang YM, Chen GY); Hangzhou Normal University, Hangzhou 310053, China(Zhang H, Kang YH, Gao YD, Zhang BB, Chen GY)

Chen Gongying, Email: liuxingli0329@163.com

Objective Study the clinical significance of HBX gene detection, sequence analysis in peripheral blood mononuclear cell(PBMC) of chronic hepatitis B(CHB) patients with serum HBV DNA negative conversion after treatment by nucleoside analogues(NAs). Methods Detected and analyzed the HBX gene sequence by real time PCR in PBMC of 60 patients with CHB including some with cirrhosis or hepatocellular carcinoma(HCC), all the serum HBV DNA had turned negative after treatment by NAs, and explore the clinical significance of the HBX gene. Results HBX genes were detected in 37 cases(61.67%, 37/60). HBX positive rates of PBMC in HCC and cirrhosis patients were higher than that of CHB patients(P=0.000,P=0.010). HBX △120, HBX△129, HBX△131 truncations were detected in two HCC and one CHB cases. Two hotspot mutation including A389T/G391A, T380C had been found, and A389T/G391A double mutation in HCC patients was significantly higher than that in CHB patients(P=0.021). In cirrhosis and HCC patients, T380C mutation rate in HBeAg(-) cases was higher than that in HBeAg(+) cases(P=0.035). Conclusions In patients with serum HBV DNA negative conversion after treatment by NAs, PBMC HBX gene positive rates in cirrhosis or HCC cases are higher than that in CHB cases. A389T/G391A double mutation rate in HCC cases is significantly higher than that in CHB cases. In cirrhosis and HCC patients, T380C mutation rate in HBeAg(-) cases is higher than that in HBeAg(+) cases.

PCR; Hepatitis B; Chronic; DNA

陈公英，Email：liuxingli0329@163.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.03.016

PCR；肝炎；乙型；慢性；DNA

浙江省科技厅(2014C37081)；杭州市科技局(20120533Q09)

2016-10-17)