西安市流感样病例中人腺病毒感染特点分析

许晶 岳姝婷 马萍 张蕾 史伟 徐艺 李慎 关路媛 王敬军 余鹏博

710054 西安, 陕西省疾病预防控制中心病毒病预防控制所(许晶、马萍、 张蕾、 史伟、徐艺、李慎、关路媛、王敬军、余鹏博)；710061 西安交通大学医学院(岳姝婷)许晶与岳姝婷对本文有同等贡献

·论著·

西安市流感样病例中人腺病毒感染特点分析

许晶 岳姝婷 马萍 张蕾 史伟 徐艺 李慎 关路媛 王敬军 余鹏博

710054 西安, 陕西省疾病预防控制中心病毒病预防控制所(许晶、马萍、 张蕾、 史伟、徐艺、李慎、关路媛、王敬军、余鹏博)；710061 西安交通大学医学院(岳姝婷)许晶与岳姝婷对本文有同等贡献

目的 分析2013—2015年西安市流感样病例中非流感患者腺病毒(HAdV)感染的流行病学特点和病毒分型特征。方法 收集2013年1月到2015年12月西安市两所国家级流感监测哨点医院的流感样病例样本，经荧光PCR筛检流感病毒阴性而腺病毒阳性的标本，进行病毒分离后对HAdV六邻体(Hexon)基因扩增、测序及分型鉴定，与HAdV 1-7型的参考序列构建基因进化树。结果 2 367份标本中检测出88例腺病毒阳性，阳性率为3.72%。共检出7种亚型的HAdV，其中HAdV-1型占9.09%，HAdV-2型占22.73%，HAdV-3型占23.86%，HAdV-4型占5.68%，HAdV-5型占7.95%，HAdV-6型占3.41%，HAdV-7型占1.14%。在腺病毒阳性病例中，男性检出率高于女性，但差异不具有统计学意义(P>0.05)；按年龄分6个组，1岁以下3例阳性，1～3岁36例阳性，4～6岁26例阳性，7～18岁16例阳性，19～59岁5例阳性，60以上2例阳性。7岁以下儿童高发，年龄组间差异具有统计学意义(χ2=0.10，P<0.05)。结论 2013—2015年西安市上呼吸道感染中HAdV的主要的流行型别为3型和2型，7岁以下儿童高发；HAdV的感染全年散发，无明显季节性。

Fund programs: Shannxi Provincial Health Science and Technology Research Project(2016D095,2016D092)

流感样病例(Influenza-like illness, ILI)即发热(体温≥38 ℃)，伴咳嗽或咽痛之一者。ILI感染的常见呼吸道病毒包括流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、冠状病毒、偏肺炎病毒、博卡病毒等十多种病毒属、型[1]，在ILI监测中流感病毒是常规监测项目，而流感病毒检测阴性的ILI，其引起感染的主导病原是临床医生和疾病控制专业人员关注的热点问题。人腺病毒(Human adenovirus，HAdV)因其流行地区广、传播能力强、人群普遍易感，常引起聚集疫情和暴发流行而倍受关注[2,4]。HAdV是一种无包膜的呈二十面体对称的线性双链DNA病毒，分为A～G共7个组，68个型别[5]，因其型别众多，其各型导致ILI在不同地区、不同时间、不同人群中的特点和规律尚不清楚，目前文献报道较少。本研究通过对2013—2015年收集自西安市两个流感监测哨点医院的、经实验室流感病毒核酸检测为阴性的ILI咽拭子标本，进一步进行HAdV检测、病毒分离、基因测序及分型鉴定，结合流行病学资料，分析本地区HAdV的流行特点和感染规律，为临床准确诊断、充分认识HAdV各型的分布规律，以及有效防控腺病毒感染而积累本底数据，并提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 标本采集与筛检 收集2013年1月到2015年12月西安市两个国家级流感监测哨点医院(解放军323医院、解放军451医院)的门诊ILI，患者于就诊当天采集其鼻咽拭子置于病毒采样液中，4 ℃运送至实验室进行检测。标本用天隆全自动核酸提取仪和天隆核酸提取试剂盒(磁珠法)(Ex-RNA/DNA病毒)进行核酸提取后，用三重荧光定量PCR法(GenTouch甲型流感/乙型流感/人腺病毒核酸检测试剂盒)将流感病毒阴性而腺病毒阳性的标本筛选出来。

1.2 腺病毒分离 将腺病毒阳性的标本接种人喉表皮癌细胞(HEP-2)，维持液为含2%胎牛血清的DMEM(美国Gibco)，每天观察细胞病变(CPE)。当CPE达到75%～100%时，收集细胞上清。Hep-2细胞为本实验室细胞库保存。

1.3 腺病毒六邻体(Hexon)基因扩增、序列测定与分型、建树 将得到的腺病毒毒株提取核酸(方法同上)，应用特异引物(上游AD1 5′-CTGATGTACTACAACAGCACTGGCAACATGGG-3′, 下游AD2∶5′-GCGTTGCGGTGGTGGTTAAATGGGTTTACGTTGTCCAT-3′)，进行PCR扩增(95 ℃ 10 min,(94 ℃ 30 s,51 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min)35个循环，72 ℃ 10 min)，产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，PCR产物的预期大小为605～629 bp。将特异DNA条带纯化后在ABI 3500xl测序仪上用双脱氧末端终止法(Sanger法)进行序列测定，测序引物同PCR引物。输出序列在GenBank网站上经BLAST比对分析，确定腺病毒型别。

将本研究获得的腺病毒Hexon基因序列，通过MEGA5.05构建和其他参考序列的亲缘性关系树。采用Kimura二参数法(Kimura 2-parameter)核苷酸进化模型和邻接法(Neighbor-Joining，NJ)，自助法(Boot-strap)进行检验(检验重复数为1000)。

1.4 统计学方法 用SPSS 18.0统计软件对计数资料进行分析，用χ2检验分析比较HadV感染在不同人群、不同季节中阳性检出率的差异，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 ILI中非流感样本腺病毒检测结果 ILI咽拭子经A/B流感病毒/腺病毒三重病原荧光Real-time PCR检测筛选出对流感病毒RNA阴性者，共2 367份，其中腺病毒阳性者88例，其阳性率为3.72%。2013—2015年HAdV检出率分别为3.51%，3.81%和3.76%，3年间ILI非流感病例中腺病毒阳性率差异无统计学意义(χ2=0.10，P>0.05)。

2.2 HAdV感染者性别及年龄分布 在检测的 2 367例非流感病例中，男性感染者HAdV的检出率为4.38%(55/1 257)，女性感染者HAdV的检出率为2.97%(33/1 110)，男女间差异无统计学意义(χ2=3.24，P>0.05)；将发病年龄分为6个年龄组，1岁以下3例阳性，1～3岁36例阳性，4～6岁26例阳性，7～18岁16例阳性，19～59岁5例阳性，60以上2例阳性(见表1)。6岁以下儿童高发，年龄组间差异具有统计学意义(χ2=0.10，P<0.05)。

表1 2013—2015年ILI中非流感病例HAdV感染者年龄分布

表2 ILI中HAdV感染者病毒分型

2.3 ILI中非流感病例HAdV感染的季节分布 ILI中非流感病例HAdV感染者的咽拭子中HAdV核酸全年均能检出，但5月份与7月份阳性检出率较高(图1)。

图1 2013—2015年西安市ILI中非流感病例HAdV感染者季节分布Fig.1 Month distribution of HAdV in Xi′an during 2013—2015

2.4 ILI中非流感病例HAdV感染者咽拭子HAdV核酸分型结果 对2 367例ILI中非流感而腺病毒阳性的88例，经PCR扩增腺病毒六邻体(Hexon)基因后，对PCR产物测序并在GenBank上BLAST比对分析，确定88例腺病毒感染者病毒基因分型为HAdV 1-7型均有。其中HAdV-1型8株，占9.09%；HAdV-2型20株，占22.73%；HAdV-3型21株，占23.86%；HAdV-4型5株，占5.68%，HAdV-5型7株，占7.95%；HAdV-6型3株，占3.41%；HAdV-7型1株，占1.14%。主要的流行型别主要为HAdV-3和HAdV-2(表2)。

2.5 人腺病毒分子分型特征及进化分析 对88例腺病毒阳性样本接种细胞，成功获得65例腺病毒Hexon基因扩增且完成序列测定者。对该65例HadV基因序列分析显示，阳性的HAdV属于3个亚群(B、C、E)的7种亚型。其中B亚群(3型、7型)占33.85%(22/65)，C亚群(1型、2型、5型、6型)占58.46%(38/65)，E亚群(4型)占7.69%(5/65)。2013—2015年3年间都出现B、C亚群，E亚群在2015未检出。2013年B亚群2株，C亚群8株，E亚群4株；2014年B亚群14株，C亚群18株，E亚群1株；2015年B亚群6株，C亚群12株。其中HAdV-C6仅在2014年检出，HAdV-B7仅在2015年检出。

将65株HAdV的Hexon基因序列(编号以年份如15+样本号如569组成序列编号15569，下同)，与文献报道较多的腺病毒流行株基因序列(GenBank序列号JX173086、AB330083、AY854178、AF542122、AY339865、FJ943597、GU230 898分别代表HAdV-1、2、3、4、5、6、7型)作参考，构建系统进化树，结果显示各HAdV型别与其对应的参考株同源性较高(图2)。

◆ GenBank中不同型别的腺病毒序列图2 基于HAdV Hexon引物扩增片段的系统进化树◆ The sequence of different types of HAdV from GenBankFig.2 Phylogenetic analysis of HAdV species based on the partial sequence of the hexon gene

3 讨论

HAdVD是一种无包膜的呈二十面体对称的线性双链DNA病毒，归属哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus)。 HAdV常侵犯呼吸道、消化道及眼结膜等，可引起广泛的疾病谱，如急性呼吸道感染、咽结膜热、肺炎、流行性角结膜炎和胃肠炎等[6,8]。全球HAdV流行地区广、人群普遍易感，常引起暴发流行[9]。目前HAdV感染尚无特效药，疫苗也仅在美国军队使用[10]。因此开展HAdV感染的调查研究，了解HAdV在人群中的感染特征很有必要。

本研究报道了西安地区2013—2015年呼吸道腺病毒的流行情况和分子分型结果，这三年HAdV的总检出率为3.72%，与深圳地区(3.86%)、无锡地区(3.22%)[11,12]检出率基本一致。在HAdV感染中，男性患者的检出率高于女性患者，但差异无统计学意义。全人群普遍易感HAdV，7岁以下儿童为易感人群。腺病毒感染各地季节性差异较大，这可能与气候、地域不同有关。如北京2003-2012年监测未见明显季节性，无锡地区、深圳市以冬春季为主[13]，南京地区[14]春夏季高发。西安地区全年均能检出HAdV，各年检出月份略有不同，检出率为5月份、7月份较高，但没有出现像流感病毒和呼吸道合胞病毒[15-17]那样规律的流行趋势。

HAdV自发现以来分为A～G 7个组，其中C组、E组及部分B组通常感染呼吸道，尤其是B亚组可引起严重的呼吸道疾病。本次研究检测出B、C、E组共7个型，显示西安地区2013—2015年引起呼吸道腺病毒感染的主要为C亚群，其次为B亚群；主要是B亚群的3型及C亚群的2型；这与其他地区报道的主要为HAdV-3型及7型有所不同。从亲缘进化的结果看，本研究中HAdV各型别序列与下载参考株的同源性较高，未发生明显变异。

HAdV作为一种在全世界范围普遍流行、容易引起暴发疫情并有广泛疾病谱的病毒，受到世界各地的重视，如美国有全国腺病毒监测网络，韩国及日本对HAdV有连续多年的监测[18,19]。在我国尚未建立腺病毒监测网络，仅有个别省份有几年监测的数据。陕西省亦无呼吸道腺病毒监测数据，流行的分子型别也是首次报道，这对于陕西省呼吸道腺病毒的防控具有指导意义。

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(本文编辑：唐浏英)

Characteristics of the human adenovirus infections from influenza-like illness samples in Xi′an

Xu Jing, Yue Shuting, Ma Ping, Zhang Lei, Shi Wei, Xu Yi, Li Shen, Guan Luyuan, Wang Jingjun, Yu Pengbo

Viroloy Research Laboratory of Shaanxi Provincial Center for Disease Control and Prevention，Xi＇an 710054，China(Xu J, Ma P, Zhang L, Shi W, Xu Y, Li S, Guan LY, Wang JJ, Yu PB)；School of Public Health, Xi′an Jiaotong University Health Science Center, Xi′an 710061, China (Yue ST) Xu Jing and Yue Shuting are the first authors who contributed equally to this article

Yu Pengbo, Email: sxcdcy@126.com

Objective To analyze the epidemiological characteristics and the molecular types of human adenovirus (HAdV) from influenza-like illness (ILI) samples with negative influenza virus in Xi'an from January 2013 to December 2015. Methods Samples from patients with ILI were collected from two national influenza sentinel surveillance hospitals during 2013—2015 in Xi′an. HAdV was detected by real-time PCR, and then the positive samples were inoculated into Hep-2 cells to isolate the viruses. The amplified products were purified and sequenced of hexon gene, and the sequences were compared with the Genebank data and phylogenetic trees were constructed. Results In 2367 samples, 88 samples were positive for HAdV, the positive rate was 3.72%. There were 7 subtypes detected, and the rates of each subtype are as follows: HAdV-1 was 9.09%, HAdV-2 was 22.73%, HAdV-3 was 23.86%, HAdV-4 was 5.68%, HAdV-5 was 7.95%, HAdV-6 was 3.41% and HAdV-7 was 1.14%. Males had higher infection rate than females, but there was no significant difference. The patients were divided into 6 groups according to age. There were 3 positive samples among those under 1 year of age, 36 positive samples among those 1 to 3 years old, 26 positive samples among those 4 to 6 years old, 16 positive samples in those 7 to 18 years old, 5 positive samples in 19 to 59 years old and 2 positive samples in those older than sixty years of age. HAdV infection was primarily confined to children under 7 years of age. Conclusions HAdV-3 and HAdV-2 were the dominant epidemic strains during 2013—2015 in Xi′an. Children younger than 7 years were the main susceptible population. HAdV infections circulate all year-round and there was no considerable seasonal variation.

Human Adenovirus; Epidemiological characteristics; Molecular typing

余鹏博，Email: sxcdcy@126.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.03.008

人腺病毒；流行特征；分子分型

陕西省卫生计生科研基金项目(2016D095，2016D092)

2017-03-06)