HPLC波长切换法同时测定宝宝乐中四种成分的含量

沈 健，张诚贤

HPLC波长切换法同时测定宝宝乐中四种成分的含量

沈 健1，张诚贤2

目的 建立HPLC波长切换法同时测定宝宝乐中芍药内酯苷、芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花素的含量。方法 采用Venusil MP C18(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)，以乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相，进行梯度洗脱，检测波长分别为230 nm(芍药内酯苷、芍药苷)和254 nm(毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素)，流速0.9 mL/min，柱温30 ℃，进样量为10 μL。结果 芍药内酯苷、芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花素4个成分的质量浓度分别在4.18～83.60 μg/mL(r=0.999 8)、5.14～102.80 μg/mL(r=0.999 5)、5.60～112.00 μg/mL(r=0.999 9)、4.72～94.40 μg/mL(r=0.999 3)范围内与峰面积呈良好的线性关系；平均加样回收率及相应的RSD分别为99.66%(0.96%)、98.17%(1.39%)、97.00%(1.48%)、99.92%(0.58%)；精密度良好，RSD≤1.06%；重复性良好，RSD≤1.69%。供试品溶液在室温条件下12 h内稳定，RSD≤1.12%。结论 所建立的方法灵敏度高、快速、专属性好、准确度高，为宝宝乐的质量控制提供了依据。

宝宝乐；芍药内酯苷；芍药苷；毛蕊异黄酮葡萄糖苷；芒柄花素；波长切换法；梯度洗脱

0 引言

宝宝乐由白芍、黄芪(蜜炙)、大枣、桂枝、干姜、山楂(炒)、六神曲(焦)、麦芽等8味中药材加工而成的中成药颗粒剂，具有温中补虚、和里缓急、开胃消食的功效，白芍[1]为方中君药，味苦、酸，微寒，养血敛阴，柔肝止痛，平肝阳，其主要成分为氧化芍药苷、芍药内酯苷和芍药苷；黄芪[1]味甘性微温，补齐固表，托疮生肌，毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花素为黄芪的有效成分。宝宝乐主要用于脾胃虚寒、脘腹隐痛、喜温喜按、胃纳不香、食少便溏等症状的治疗。

宝宝乐标准收载于《卫生部颁药品标准》中药成方制剂第七册，是一种儿童常用药物，服用方便，其现行标准仅规定了制法、性状及冲剂的通则检查项，对所含成分未进行定量检测研究[2]，也未检索到对该制剂多组分进行定量测定的文献报道，难以全面有效地控制本品的质量。多指标控制能更好地反映中成药的质量，本文对白芍的指标性成分芍药内酯苷、芍药苷，黄芪的指标性成分毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素，采用HPLC波长切换法同时进行了测定，现报道如下。

1 仪器与试药

Agilent 1100系列四元梯度泵高效液相色谱仪[四元梯度泵、自动进样器、柱恒温箱、可变波长检测器(VWD)](美国安捷伦公司)；BS423S型分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；KQ-500DE超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)。

毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品(111920-201505，含量97.1%)、芒柄花素对照品(111703-201504，含量100.0%)、芍药苷对照品(110736-201640，含量95.2%)来源于中国食品药品检定研究院；芍药内酯苷对照品(39011-90-0，含量98.0%)来源于上海纯优生物科技有限公司。宝宝乐(5 g/袋，批号：615010、615016、616011)来源于河南宛东药业有限公司；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 采用Venusil MP C18(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)色谱柱；流动相A：乙腈，流动相B：0.1%磷酸溶液，梯度洗脱(0～12 min，15.0%A；12～23 min,15.0%A→22.0%A；23～32 min,22.0%A→38.0%A；32～40 min,38.0%A→15.0%A)；0～23 min时在230 nm[3]波长下检测芍药内酯苷和芍药苷，23～40 min在254 nm[4]波长下检测毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花素。流速：0.9 mL/min；柱温：30 ℃；进样量10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 分别精密称取对照品芍药内酯苷、芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花素各适量，用甲醇分别制得芍药内酯苷0.418 mg/mL、芍药苷0.514 mg/mL、毛蕊异黄酮葡萄糖苷0.560 mg/mL、芒柄花素0.472 mg/mL单一成分的对照品储备溶液。再分别依次量取上述各对照品储备液2.5、5.0、1.0、2.5 mL，置同一个量瓶中，用甲醇稀释至50 mL，振摇均匀，即得试验用混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取宝宝乐适量，研细，取约1.0 g，精密称定，置50 mL量瓶中，加入甲醇45 mL，超声处理30 min，放冷，再用甲醇稀释至刻度，振摇均匀，过滤，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性样品溶液的制备 按宝宝乐质量标准项下的处方工艺，分别制备不含白芍的阴性样品和不含黄芪的阴性样品，按“2.2.2”项下方法制成白芍阴性样品溶液和黄芪阴性样品溶液。

2.3 专属性考察 精密吸取“2.2.1～2.2.3”项下制备的4个溶液各适量，按上述色谱条件进行检测。试验结果表明，白芍阴性样品溶液和黄芪阴性样品溶液的色谱图中，在所测芍药内酯苷、芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花素4个成分对应的位置无干扰，分离度均符合要求，理论塔板数均>2 500，色谱图见图1。

2.4 线性范围考察 分别精密吸取“2.2.1”项下制备的对照品储备液各0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，置于6个10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，振摇均匀，即得到6个系列浓度的混合对照品溶液，按照上述测定方法进行测定，采用质量浓度X作为横坐标，测得的峰面积Y作为纵坐标，进行线性回归，回归方程及线性范围如表1所示。

图1 色谱图

所测组分回归方程线性范围(μg/mL)r芍药内酯苷Y=6.5726×105X+417.94.18～83.600.9998芍药苷Y=9.1311×105X+181.25.14～102.800.9995毛蕊异黄酮葡萄糖苷Y=3.0413×105X-263.85.60～112.000.9999芒柄花素Y=7.0125×105X+448.04.72～94.400.9993

2.5 精密度考察 取混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，连续进样6次，记录峰面积，结果芍药内酯苷、芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花素峰面积的RSD(n=6)分别为0.92%、0.85%、1.06%和0.98%。

2.6 重复性考察 取宝宝乐样品(批号：615010)6份，按“2.2.2”项下制备方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，分别计算芍药内酯苷、芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花素的含量，并计算芍药内酯苷、芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花素含量的RSD，结果所测4个组分的RSD依次为1.42%、1.37%、1.69%和1.34%。

2.7 稳定性考察 取批号为615010宝宝乐样品的同一供试品溶液，室温下放置0、2、4、6、8、12 h，考察供试品溶液在室温下储存的稳定性，按“2.1”项下色谱条件测定芍药内酯苷、芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花素的峰面积值，结果其RSD分别为1.01%、0.96%、1.12%、1.07%。结果显示，供试品溶液自制备起，在室温下12 h内稳定。

2.8 加样回收率考察 取批号为615010的宝宝乐样品，研成细粉，取细粉6份，每份约0.5 g，精密称定，分置不同的50 mL量瓶中，精密加入上述制备的混合对照品溶液25 mL、甲醇20 mL，采用超声波超声处理30 min，放冷，用甲醇稀释至刻度，振摇均匀，过滤，即得加样回收样品试液。按“2.1”项下色谱条件及上述检测方法，计算芍药内酯苷、芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花素的回收率及RSD，结果其回收率分别为99.66%、98.17%、97.00%、99.92%，RSD分别为0.96%、1.39%、1.48%、0.58%。

2.9 样品测定 取3批宝宝乐，按“2.2.2”项下制备方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件下进样测定，结果见表2。

表2 含量测定结果(n=3,mg/g)

3 讨论

3.1 提取溶剂的选择 在实验过程中，笔者对不同的提取溶剂(50%甲醇、甲醇[5-6]、50%乙醇[7]、乙醇)进行了考察，以所测各组分芍药内酯苷、芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花素的提取率为指标，优选最佳的提取溶剂。结果以甲醇为提取溶剂时，所测4个组分的提取率最佳。

3.2 流动相的选择 本文分别考察了乙腈-水[4,8]、乙腈-0.2%乙酸溶液[9]、乙腈-0.02%磷酸溶液[5]、乙腈-0.1%磷酸溶液[10]等流动相体系，以所测各组分的分离效果、峰形等为指标，优选最佳的流动相体系。结果以乙腈-水为流动相体系梯度洗脱时，毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花素能达到有效分离，但芍药内酯苷和芍药苷分离效果不佳；以乙腈-0.2%乙酸溶液为流动相体系梯度洗脱时，芍药内酯苷和芍药苷峰形较好，但芒柄花素与其他杂质峰达不到有效分离；以乙腈-0.02%磷酸溶液为流动相体系梯度洗脱时，毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰形较差，存在拖尾现象；采用乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相体系梯度洗脱时，基线较平稳，所测各组分峰形较好，均能达到有效分离，故选取乙腈-0.1%磷酸溶液按照文中的梯度洗脱程序对芍药内酯苷、芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花素同时进行测定。

4 小结

本研究表明，本文所建立的HPLC波长切换联合梯度洗脱法，操作简便、准确，重复性好，能够有效控制宝宝乐的质量，确保临床用药的安全性和疗效的一致性，为进一步完善宝宝乐的质量标准提供了有力的数据支持。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京:中国医药科技出版社,2015:105,302-303.

[2] 中华人民共和国卫生部药典委员会.卫生部颁药品标准(中药成方制剂第七册)[S].北京:人民卫生出版社,1993:103.

[3] 李伟铭,赵月然,杨燕云,等.HPLC波长切换法同时测定白芍饮片中9个成分的含量[J].药物分析杂志,2011,31(12):2208-2212.

[4] 梁瑾,刘小花,任远,等.HPLC-DAD-ELSD法同时测定黄芪中5个成分的含量[J].药物分析杂志,2013,33(2):210-213.

[5] 欧金梅,吴德玲,金传山,等.HPLC法同时测定白芍总苷中4种单萜苷的含量[J].中药材,2013,36(3):423-425.

[6] 纪松岗,李翔,娄子洋,等.高效液相色谱法测定黄芪中毛蕊异黄酮苷和芒柄花素的含量[J].第二军医大学学报,2006,27(1):81-84.

[7] 刘金环,杨玉琴,丁秦,等.HPLC法同时测定白芍药材中芍药内酯苷和芍药苷的含量[J].河南中医,2013,33(10):1796-1797.

[8] 王晓辉,刘涛,李清,等.高效液相色谱法同时测定黄芪中的五种异黄酮类成分[J].色谱,2006,24(5):486-488.

[9] 陆小云,楚楚,颜继忠.超高效液相色谱法同时测定白芍中芍药苷和芍药内酯苷的含量[J].中南药学,2012,10(2):98-100.

[10]杜伟锋,胡淑珍,吴芳,等.不同等级杭白芍中3个有效成分的考察[J].中成药,2014,36(2):358-362.

Simultaneous determination of the content of four constituents in Baobaole by HPLC wavelength switching method

SHEN Jian1,ZHANG Cheng-xian2

(1.Huzhou Central Hospital,Huzhou 313000,China;2.Huzhou Institute for Food and Drug Control,Huzhou 313000,China)

Objective To develop an HPLC wavelength switching method for simultaneous determination of the content of alibiflorin,paeoniflorin,calycosin7-O-β-D-glucopyranoside and formononetin in Baobaole.Methods The Venusil MP C18(250 mm×4.6 mm,5.0 μm)chromatographic column was adopted;the mobile phase was acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution with gradient elution,at a flow rate of 0.9 mL/min.The detection wavelengths were 230 nm(determination of alibiflorin and paeoniflorin),and 254 nm(determination of calycosin7-O-β-D-glucopyranoside and formononetin).The column temperature was set at 30 ℃,and the sample quantity was 10 μL.Results The concentration of alibiflorin,paeoniflorin,calycosin7-O-β-D-glucopyranoside and formononetin was respectively 4.18～83.60 μg/mL(r=0.999 8),5.14～102.80 μg/mL(r=0.999 5),5.60～112.00 μg/mL(r=0.999 9) and 4.72～94.40 μg/mL(r=0.999 3).The average recoveries and the correspondingRSDwere 99.66%(0.96%),98.17%(1.39%),97.00%(1.48%) and 99.92%(0.58%),respectively.The precision was good,RSD≤1.06%;the repeatability was goodRSD≤1.69%.Test solution was stable at room temperature within 12 h,RSD≤1.12%.Conclusion The established method is rapid,with high sensitivity,good specificity and high accuracy,which can be applied to the quality control of Baobaole.

Baobaole;Alibiflorin;Paeoniflorin;Calycosin7-O-β-D-glucopyranoside;Formononetin;Wavelength switching method;Gradient elution

2016-09-30

1.湖州市中心医院，浙江 湖州 313000；2.湖州市食品药品检验研究院，浙江 湖州 313000

10.14053/j.cnki.ppcr.201705021