灯盏花素对大鼠肺缺血再灌注损伤后细胞凋亡的影响及机制研究

毛哲哲，陈奎利，王慧玲，程 忠，冯 强

灯盏花素对大鼠肺缺血再灌注损伤后细胞凋亡的影响及机制研究

毛哲哲*，陈奎利，王慧玲，程 忠，冯 强

目的 研究灯盏花素(Breviscapine，Bre)对大鼠肺缺血再灌注损伤后细胞凋亡以及凋亡相关基因、蛋白表达的影响，探讨其可能的作用机制。方法 通过夹闭左肺门45 min的方法，建立大鼠肺缺血再灌注损伤模型，术前30 min，分别给予不同浓度灯盏花素(12.5、25、50 mg/kg)和舒血宁(4 mg/kg)，并设假手术组和模型组。再灌注2 h后，测定肺组织湿/干重比(W/D)，TUNEL法检测肺细胞凋亡，RT-PCR法检测肺组织中bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达，比色法测定肺组织中抗氧化酶活性和丙二醛(MDA)含量，Western blot法测定肺组织中NF-κB蛋白表达。结果 与模型组比较，经灯盏花素干预能够显著降低肺缺血再灌注损伤大鼠肺组织W/D，减轻肺水肿，降低肺细胞凋亡指数(AI)，改善肺细胞凋亡状况，上调bcl-2 mRNA表达，下调Bax mRNA表达，提高bcl-2/Bax比值，改善抗氧化酶(SOD、CAT)活性，降低MDA含量，下调NF-κB蛋白表达，上述作用均具有一定剂量依赖性。结论 灯盏花素可能通过调节凋亡相关基因、蛋白表达而对肺缺血再灌注损伤大鼠肺细胞凋亡起到抑制作用，对肺缺血再灌注损伤起到一定的保护作用。

灯盏花素；肺缺血再灌注；凋亡；机制

0 引言

灯盏花是菊科植物短葶飞蓬的干燥全草，又名灯盏细辛，为我国传统中药品种，首载于《滇南本草》，其性寒、微苦、甘温辛，具有祛风除湿、活血化瘀、通经活络、消炎止痛之功效。灯盏花素(Breviscapine，Bre)是灯盏花的主要活性成分，现代药学研究发现，Bre属于黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化、改善血液循环等多种生物学活性[1-4]。Bre对脑组织、心肌、肾脏、肝脏等组织器官缺血再灌注损伤均具有一定的保护作用[4-7]，但Bre是否对肺缺血再灌注损伤具有保护作用尚未见文献报道。本研究采用夹闭左肺门45 min后恢复血流灌注的方法，制备大鼠肺缺血再灌注模型，研究Bre对肺缺血再灌注损伤后细胞凋亡的影响，探讨Bre对肺缺血再灌注损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 120只实验用SD大鼠(雄性，清洁级，鼠龄6～7周，体重200～240 g)，购自河北省实验动物中心，动物许可证号：SCXK(冀)2013-1-003。

1.2 试验药物与试剂 灯盏花素注射液购自石药银湖制药有限公司(批号：1011411024)；舒血宁注射液购自神威药业有限公司(批号：20131126)；TUNEL试剂盒和超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)试剂盒购自北京博奥森生物工程有限公司；bcl-2、Bax上下游引物购自上海博亚生物公司；NF-κB单体购自碧云天生物技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 分组与模型的制备 将120只实验用SD大鼠按随机数字表法随机分为假手术组、模型组、灯盏花素(12.5、25、50 mg/kg)组和舒血宁(4 mg/kg)组，各20只；参照贾俊海等[6]报道的实验方法制备大鼠肺缺血再灌注模型，假手术组大鼠行手术通路而不夹闭血管。各治疗组分别于术前30 min腹腔注射给药，假手术组和模型组同步给予等体积生理盐水；再灌注2 h后，取标本行各指标检测。

1.3.2 肺组织湿/干比重(W/D)的测定 每组随机取6只大鼠，麻醉后取肺组织称重为湿重(W)，置60 ℃烘箱24 h后称重为干重(D)，然后计算W/D。

1.3.3 细胞凋亡状况观察 每组随机取6只大鼠，麻醉后开胸取肺组织，置于4%多聚甲醛溶液进行固定，经常规脱水、石蜡包埋、切片、常规脱蜡水化、TUNEL染色和封片处理后，通过显微镜观察肺组织细胞凋亡状况并照相保存。计算细胞凋亡指数(Apoptosis index，AI)：每张染色切片于相同位置取6个不重叠的视野，分别计数每个视野中总细胞数和凋亡细胞数，然后计算AI∶AI(%)=(凋亡细胞数/总细胞数)×100%。

1.3.4 bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达的检测 首先查阅并设计大鼠bcl-2、Bax、β-actin上下游引物序列；每组剩余8只大鼠麻醉后取肺组织，研磨匀浆，提取总RNA并测定浓度，取1 μg RNA进行反转录后行PCR扩增反应，取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，由凝胶成像仪观察并照相；以β-actin为内参，以灰度值进行半定量分析bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达并计算bcl-2/Bax比值。

1.3.5 肺组织抗氧化酶活性和MDA含量的测定 取肺组织匀浆液，经3 500 r/min离心10 min后取上清液，通过紫外-可见分光光度计测定抗氧化酶(SOD、CAT)活性和MDA含量。

1.3.6 肺组织中NF-κB蛋白表达的检测 取肺组织匀浆液，低温离心(4 ℃，12 000 r/min，10 min)后取上清液，采用BCA法测定蛋白浓度，进行蛋白变性(沸水浴加热5 min)、上样(每孔上样30 μg)，经SDS-PAGE凝胶电泳后转PVDF膜、室温下5%脱脂奶粉封闭2 h，一抗(NF-κB，β-actin)4 ℃过夜，洗膜，二抗(1∶100)室温孵育1 h后经ECL系统显影；以β-actin为内参，以条带灰度值测定NF-κB相对表达量。

2 结果

2.1 Bre对肺缺血再灌注大鼠肺组织W/D的影响 结果如表1所示。模型组大鼠肺组织W/D较假手术组显著升高(P<0.01)，与模型组比较，Bre(25、50 mg/kg)或舒血宁(4 mg/kg)预处理能显著降低肺缺血再灌注损伤大鼠肺组织W/D值(P<0.05，P<0.01)。Bre(12.5、25、50 mg/kg)组W/D值与舒血宁组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.2 Bre对肺缺血再灌注大鼠肺细胞凋亡状况的影响 各组大鼠肺组织细胞凋亡状况如图1所示。模型组大鼠肺组织凋亡细胞数量较假手术组明显增多；与模型组比较，Bre各浓度组和舒血宁组肺组织凋亡细胞数量呈不同程度减少，该作用具有一定的剂量依赖性。AI结果如表1所示。模型组大鼠肺组织细胞AI较假手术组显著升高(P<0.01)，与模型组比较，Bre(25、50 mg/kg)或舒血宁(4 mg/kg)预处理能够显著降低肺缺血再灌注损伤大鼠肺组织细胞AI值(P<0.05，P<0.01)。与舒血宁组比较，Bre 50 mg/kg组大鼠肺组织细胞AI显著降低(P<0.05)。

2.3 Bre对肺缺血再灌注大鼠肺组织bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达及bcl-2/Bax比值的影响 结果见表2。模型组大鼠肺组织中bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达较假手术组显著上调(P<0.05，P<0.01)，bcl-2/Bax比值显著降低(P<0.01)；与模型组比较，Bre(25、50 mg/kg)或舒血宁预处理能够显著上调肺缺血再灌注大鼠肺组织bcl-2 mRNA表达(P<0.05，P<0.01)，下调Bax mRNA表达(P<0.05，P<0.01)，并显著提高bcl-2/Bax比值(P<0.01)。与舒血宁4 mg/kg组比较，Bre 50 mg/kg组bcl-2 mRNA表达显著上调(P<0.05)、bcl-2/Bax比值显著升高(P<0.05)，而Bax mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)。

图1 Bre对肺缺血再灌注大鼠肺细胞凋亡状况的影响

表1 Bre对肺缺血再灌注大鼠肺组织W/D和细胞凋亡率的影响

注：与模型组比较，*P<0.05,**P<0.01；与舒血宁组比较，#P<0.05

2.4 Bre对肺缺血再灌注大鼠肺组织中SOD、CAT活性和MDA含量的影响 结果如表3所示。模型组大鼠肺组织中SOD、CAT活性显著降低(P<0.01)，MDA含量显著升高(P<0.01)；与模型组比较，Bre(25、50 mg/kg)预处理能够显著提高肺缺血再灌注大鼠肺组织中SOD、CAT活性(P<0.05，P<0.01)，并显著降低MDA含量(P<0.01)；经舒血宁(4 mg/kg)预处理，能够显著提高SOD活性，并显著降低MDA含量(P<0.05)，CAT活性差异无统计学意义(P>0.05)。与舒血宁4 mg/kg组比较，Bre 50 mg/kg组SOD、CAT活性显著升高，MDA含量显著降低(P<0.05)。

2.5 Bre对肺缺血再灌注大鼠肺组织NF-κB蛋白表达的影响 结果如图2和表4所示。模型组大鼠肺组织NF-κB蛋白表达显著上调(P<0.01)；与模型组比较，Bre(25、50 mg/kg)或舒血宁(4 mg/kg)预处理能够显著下调肺缺血再灌注大鼠肺组织NF-κB蛋白表达(P<0.05，P<0.01)。与舒血宁4 mg/kg组比较，Bre 50 mg/kg组NF-κB蛋白表达显著上调(P<0.05)。

表2 Bre对肺缺血再灌注大鼠肺组织bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达及bcl-2/Bax比值的影响

注：与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01；与舒血宁组比较，#P<0.05

表3 Bre对肺缺血再灌注大鼠肺组织中SOD、CAT活性和MDA含量的影响

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；与舒血宁组比较，#P<0.05

图2 Bre对肺缺血再灌注大鼠肺组织NF-κB蛋白表达的影响

组别只数NF-κB/β-actin假手术组80.17±0.06模型组80.45±0.13△△Bre12.5mg/kg组80.41±0.11Bre25mg/kg组80.38±0.07*Bre50mg/kg组80.20±0.05**##舒血宁4mg/kg组80.37±0.09*

注：与假手术组比较，△△P<0.01；与模型组比较，*P<0.05,**P<0.01；与舒血宁组比较，##P<0.01

3 讨论

肺部手术过程中往往需要阻断血流以减少出血，但缺血再灌注损伤并发症的存在严重影响着患者的预后。肺缺血再灌注损伤的发生发展具有非常复杂的病理机制，其中继发性肺细胞凋亡发挥着重要作用[8]。因此，以抑制细胞凋亡为切入点研发新药物，或许是改善肺缺血再灌注损伤的有效途径。

Bre是一种具有抗炎、抗氧化、改善血液循环等多种药理学作用的黄酮类化合物[1-4]。舒血宁的活性成分为银杏叶提取物，具有抗氧化、抑制细胞凋亡、降血脂等多种药理学作用[9-11]，临床上广泛应用于脑部、周围血流循环障碍性疾病。既往研究发现，银杏叶提取物能够通过降低氧化应激损伤、抑制细胞凋亡而对肺缺血再灌注损伤起到明显的保护作用[12-14]。本实验通过夹闭左肺门45 min后恢复血流的方法建立肺缺血再灌注损伤大鼠模型，给予不同剂量灯盏花素(12.5、25、50 mg/kg)进行干预治疗，以舒血宁为阳性对照药物，研究灯盏花素对大鼠肺缺血再灌注损伤后细胞凋亡的影响，并初步探讨其量-效关系。研究发现，经Bre(25～50 mg/kg)预处理，能够显著缓解肺缺血再灌注损伤大鼠肺水肿、抑制肺细胞凋亡(P<0.05，P<0.01)，Bre 50 mg/kg组肺缺血再灌注损伤大鼠肺组织W/D和AI均低于Bre 25 mg/kg组，且Bre 50 mg/kg组AI显著低于舒血宁4 mg/kg组(P<0.05)，提示Bre对肺缺血再灌注损伤大鼠细胞凋亡具有剂量依赖性的抑制作用，表现出Bre对肺缺血再灌注损伤具有一定的保护作用。

细胞凋亡是一种由多种基因参与调控的程序化死亡过程，其中bcl-2基因家族起着非常重要的调控作用。bcl-2能够抑制线粒体破裂，并可直接与凋亡刺激因子结合而抑制促凋亡蛋白caspase-3激活，抑制促凋亡蛋白Bax细胞毒性作用，调节细胞内钙浓度，从而起到抑制细胞凋亡的作用；Bax也属于bcl-2基因家族成员，它能够诱导线粒体渗透性改变而释放细胞色素C，激活促凋亡蛋白caspase-9，而表现出促细胞凋亡作用[15]。此外，Bax能够与bcl-2聚合成二聚体，从而抑制bcl-2活性而促进细胞凋亡，所以Bax/bcl-2比值更加能够体现bcl-2基因家族对细胞凋亡的调控作用[16]，Bax/bcl-2比值越高，往往凋亡状况越严重。本研究发现，经Bre(25～50 mg/kg)预处理，能够显著上调肺缺血再灌注损伤大鼠肺组织bcl-2表达，并下调Bax表达、提高bcl-2/Bax比值(P<0.05，P<0.01)；并且Bre 50 mg/kg组bcl-2 mRNA表达较舒血宁4 mg/kg组显著升高，bcl-2/Bax比值更高(P<0.05)，这可能是Bre诱导肺缺血再灌注损伤大鼠肺组织细胞凋亡重要的分子机制之一。

氧化应激损伤是细胞凋亡最重要的诱发因素之一，常态下体内氧自由基(ROS)的生成与清除处于动态平衡，其中抗氧化酶SOD、CAT对ROS的清除发挥着重要的催化作用[17]；而当缺血实现再灌注后，随着氧的大量涌入，ROS大量生成和过剩而攻击细胞膜，造成脏器的脂质过氧化损伤，因此，脂质过氧化终产物MDA的含量也能够间接反映氧化应激损伤程度。NF-κB被称为连接氧化应激损伤和细胞凋亡的“桥梁”[18-19]，常态下NF-κB无活性，当细胞受到ROS攻击时，NF-κB将被活化而促进巨噬细胞活化和浸润，诱导促凋亡信号释放而导致细胞凋亡。本研究发现，经Bre(25～50 mg/kg)预处理，能够显著改善肺缺血再灌注大鼠肺组织SOD、CAT活性，并显著降低MDA含量(P<0.05，P<0.01)，显著下调NF-κB蛋白表达(P<0.05，P<0.01)；并且Bre 50 mg/kg组SOD、CAT活性较舒血宁4 mg/kg组显著升高(P<0.05)，MDA含量显著降低(P<0.05)，提示Bre具有抑制肺缺血再灌注大鼠氧化应激损伤的作用，这可能是Bre抑制细胞凋亡的重要机制之一。

综上所述，Bre具有剂量依赖性抑制肺缺血再灌注损伤大鼠肺细胞凋亡的作用，表现出对肺缺血再灌注损伤具有一定的保护作用，其机制可能与调节凋亡相关基因表达(上调bcl-2表达、下调Bax表达，提高bcl-2/Bax比值)和相关蛋白表达(下调NF-κB蛋白表达)、改善抗氧化酶活性而抑制氧化应激损伤有关。

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Effects and mechanism of breviscapine on cell apoptosis in the rats with pulmonary ischemia-reperfusion injury

MAO Zhe-zhe*,CHEN Kui-li,WANG Hui-ling,CHENG Zhong,FENG Qiang

(Handan Central Hospital of Hebei,Handan 056001,China)

Objective To investigate the effects of breviscapine on lung cell apoptosis,the expression of apoptosis-related genes and protein in the rats with pulmonary ischemia-reperfusion injury,and to explore its possible mechanism.Methods The pulmonary ischemia-reperfusion model rats were made by clipping left lung door for 45 min and were treated with Bre (12.5,25,50 mg/kg) and Shuxuening (4 mg/kg) at 30 min before the operation,and the sham operation group and model group were set up.Two hours after reperfusion,the wet/dry (W/D) ratio of lung tissue was examined;the apoptosis of lung tissue cells were observed by TUNEL staining;the expression of bcl-2 mRNA and Bax mRNA in lung tissue was determined;the activity of antioxidase and the content of MDA in lung tissue were determined;the expression of NF-κB in lung tissue was determined by Western blot.Results Compared with model group,the lung tissue W/D of the rats in Bre-treated groups was significantly decreased,the AI was significantly decreased and the lung cells apoptosis was significantly improved;the expression of bcl-2 mRNA was significantly up-regulated and the Bax mRNA was significantly down-regulated;the ratio of bcl-2/Bax was significantly increased;the activity of SOD and CAT in lung tissue were significantly increased and the content of MDA was significantly decreased;the expression of NF-κB protein was significantly decreased;all of the effects above-mentioned were some dose-dependent.Conclusion Bre has inhibitive effects on lung cells apoptosis through altering the expression of apoptosis-related genes and protein,which suggests that Bre has protective effects on the rats with pulmonary ischemia-reperfusion injury.

Breviscapine;Pulmonary ischemia-reperfusion;Apoptosis;Mechanism

2016-08-11

河北省邯郸市中心医院，河北 邯郸 056001

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201705002