母牛卵泡期和黄体期子宫颈6种β-防御素的变化

王 皓，王 雪，王 晨，张贵学

(东北农业大学 动物科学技术学院，黑龙江 哈尔滨 150030)



实验研究

母牛卵泡期和黄体期子宫颈6种β-防御素的变化

王 皓，王 雪，王 晨，张贵学*

(东北农业大学 动物科学技术学院，黑龙江 哈尔滨 150030)

为了解母牛生殖道β-防御素的表达及与发情周期的关系，实验采用荧光定量PCR检测卵泡期和黄体期母牛子宫颈6种β-防御素的变化。实验发现，在子宫颈中卵泡期和黄体期BNBD-4、BNBD-5的表达量无差异(P>0.05)，而卵泡期TAP、LAP1、BNBD-1、BNBD-10的表达量高于黄体期(P<0.05)。母牛子宫颈中6种β-防御素均有表达，其中TAP、LAP1、BNBD-1、BNBD-10的表达量呈周期变化，可能与发情周期中子宫颈口开张程度有关。

母牛；子宫颈；β-防御素

防御素是机体抵御环境微生物侵袭的重要屏障，可参与机体的适应性免疫和先天性免疫[1]。1991年Diamond[2]在牛的气管黏膜内发现了第一种β-防御素，即气管上皮抗菌肽(TAP)，后来相继在牛舌的鳞状上皮细胞、呼吸道、胃肠道、结膜和泌尿生殖道以及脑和胎盘中发现舌抗微生物肽(LAP)[3, 4]，在牛的嗜中性粒细胞中发现了13种β-防御素即BNBD-1～13[5]。有研究证实，LAP、TAP、BNBD-4在牛子宫内膜上皮细胞中表达[6]，雌性牦牛卵巢、输卵管、子宫、阴道等组织均可表达LAP基因[7]。王桂荣等[8]从乳牛子宫内膜中扩增出防御素BNBD-5基因，证实乳牛子宫内膜中有防御素基因的表达。牛发情周期由卵泡期和黄体期组成，防御素的变化是否与发情周期变化有关在牛还未见报道。很有必要对牛生殖道β-防御素发情周期中的变化进行研究，为提高母牛繁殖率提供理论和实践依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与样品采集

实验动物选取成年健康中国荷斯坦母牛，来自哈尔滨市道外区屠宰场。屠宰后立刻选取4头正常火山口型黄体(黄体期)和4头卵巢上有明显卵泡(卵泡期)的母牛的生殖器官，取子宫颈，将样品横切成约1 cm×1 cm小块，冰冷的生理盐水漂洗除去附着物，放入EP管，液氮中冷冻保存备用。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 试剂与药品

FastStart Universal SYBR Green Master (Rox)，购自德国罗氏公司；Trizol试剂，购自哈尔滨英俊生物技术有限公司；oligo dT引物、PrimeSTAR HS (Premix)、Easy Taq酶、dNTP、DNA Marker、RNase Inhibitor和各种内切酶，购自宝生物工程(大连)有限公司；2×Taq PCR MasterMix，购自北京天根公司；琼脂糖(Agarose)购自北京原平皓生物技术公司；ImProm-II reverse transcriptase，购自Promega公司；其他常规化学试剂源自东北农业大学设备处。

1.2.2 引物设计与合成

6种牛β-防御素cDNA序列通过GenBank查找，引物用Primer Premier 5.0和oligo 6设计得到。内参基因为GAPDH2基因，用GAPDH1基因检测反转录结果，引物序列见表1。引物合成自北京华大基因生物技术有限公司。

表1 基因特异性引物信息Table 1 List of gene specific primers

1.3 方法

1.3.1 提取子宫颈总RNA

本实验通过Trizol法提取母牛子宫颈总RNA，用DEPC水溶解RNA沉淀,后放置于-80℃保存备用。

1.3.2 子宫颈总RNA反转录

子宫颈总RNA经1.2%琼脂糖凝胶电泳(120 V，30 min)，分析合格后进行反转录。反转录过程按照试剂盒说明书进行操作，反转录得到的cDNA放置于-20℃保存备用。

1.3.3 实时荧光定量PCR检测

以1.3.2步骤得到的 cDNA 稀释液为模板，对实验目的基因和内参基因(GAPDH2)进行荧光定量PCR检测，采用罗氏FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)试剂盒和ABI Prism 7500 sequence detection system，10 μl体系，在冰上配制，反应体系及反应条件参考于娜[9]。

1.3.4 2-ΔΔCt的计算方法

ΔCt=目的基因的Ct值—内参基因的Ct值。

ΔΔCt=(实验组目的基因Ct值—实验组内参基因Ct值)—(对照组目的基因Ct值—对照组内参基因Ct值)。

目的基因相对表达量=2-ΔΔCt。

1.3.5 数据统计

数据表示为平均值(Means)±标准差(SD)，统计分析使用SPSS 13.0软件T检验单因素方差分析(LSD)法进行显著性检验，P<0.05表示两组数有统计学意义的显著性差异。试验重复4×3次。

2 实验结果

2.1 总RNA提取结果

用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测所提取子宫颈的总RNA(图1)，实验得到清晰且无拖尾的三条带，说明母牛子宫颈样品 RNA是完整的。

图1 总RNA提取结果M.DL-2000 Marker；1.RNA产物；2.RNA产物

2.2 内参电泳结果

以样品反转录得到的cDNA为模板，进行内参基因表达的鉴定。凝胶电泳得到样品反转录的清晰、单一条带(图2)，即全部样品的内参均在子宫颈中有所表达。

图2 组织样品内参电泳结果M.DL-2000 Marker；1. PCR产物；2. PCR产物

2.3 β-防御素基因表达

由图3可知：在子宫颈中，卵泡期和黄体期BNBD-4、BNBD-5的表达量无差异(P>0.05)，而卵泡期TAP、LAP1、BNBD-1、BNBD-10的表达量高于黄体期(P<0.05)。

图3 发情周期子宫颈β-防御素表达

3 讨论与分析

Quayle AJ 等[10]研究发现，雌性生殖道防御素受雌激素的影响，在不同生理周期呈现不同的表达量。本实验表明，TAP、LAP1、BNBD-1、BNBD-4、BNBD-5、BNBD-10这6种β-防御素在母牛子宫颈中均有表达，且TAP、LAP1、BNBD-1、BNBD-10的表达量呈周期变化。

另外，6种防御素中BNBD-10明显高于其他，推测BNBD-10可能在子宫颈防御机制中起主要作用。卵泡期雌二醇升高，子宫颈舒张有利于精子进入[11，12]。此时期子宫受外界环境影响较大,可能导致各种防御素相较黄体期表达较高。

4 结论

母牛子宫颈中TAP、LAP1、BNBD-1、BNBD-4、BNBD-5、BNBD-10这6种β-防御素均有表达，BNBD-10在其中发挥主要作用。其中TAP、LAP1、BNBD-1、BNBD-10的表达量呈周期变化，可能与发情周期中子宫颈口开张程度有关。

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2017-04-14

国家国际科技合作项目子课题(项目号：2011DFA30760-2-1)。

王皓(1993-)，男，硕士研究生。

*通信作者：张贵学，男，博士，教授。 Email：Gxzhang@neau.edu.cn

S823.3

A

1005-2739(2017)04-0003-04