鱼类促性腺激素基因研究进展

吕绍巾， 张天民， 赵 文

(大连海洋大学 水产与生命学院， 大连 116021)

鱼类促性腺激素基因研究进展

吕绍巾， 张天民， 赵 文

(大连海洋大学 水产与生命学院， 大连 116021)

促性腺激素在鱼类性成熟及排卵过程中起着至关重要的作用，而对于鱼类促性腺激素的种类的争论也在1975年之后逐渐平息。普遍认为，鱼类的两种促性腺激素亚基GtHI和GtHII，其生化结构与生物学特征与哺乳动物的促卵泡激素(FSH)和促黄体生成素(LH)亚基相类似。随着分子生物学的逐渐发展，对促性腺激素的研究也越来越深入。综述了促性腺激素的基础生物学研究概况，包括其生化结构、生理功能以及调控机制等，同时总结了目前硬骨鱼类促性腺激素基因克隆现状，以及鱼类促性腺激素的定量分析和重组表达，为鱼类的繁育生理研究工作提供方便，为进一步探究促性腺激素的作用机理奠定基础。

促性腺激素；基因；表达；鱼类

鱼类的性成熟及产卵过程受脑垂体-性腺激素调节控制，促性腺激素(gonadotropic hormone，GtH)是在脑-垂体-性腺轴中十分重要的激素，它的分泌和合成涉及信号转导、协调基因表达、蛋白质翻译、修饰、折叠和最后分泌等[1]。随着分子生物学的逐渐发展，越来越多的研究把焦点放在了鱼类的繁殖生理方向上，对鱼类促性腺激素的研究逐渐深入。而激素调控是一个十分复杂的过程，一种激素的改变很有可能会引发其他激素的变化。许多因素都可以影响到硬骨鱼类的生殖发育，其中由垂体分泌的GtH起主要作用。有研究表明，生长激素的分泌受到促性腺激素含量的影响，在金鱼(Carassiusauratus)体内，生长激素对卵泡的发育也起到了一定程度上的调节作用。因此，进一步探究硬骨鱼类的促性腺激素在生殖周期调控作用中的分子机制，从而完善鱼类繁殖内分泌的研究势在必行。同时也为鱼类人工繁殖提供催产途径奠定基础。本文综述了鱼类GtH的结构和功能、GtH基因的克隆和表达研究进展，目的是为了鱼类的繁育生理研究工作提供参考。

1 促性腺激素的基础生理学研究

促性腺激素是由脊椎动物脑垂体分泌的促进性腺发育和繁殖的主要内分泌因素。主要包括促卵泡激素(follicle-stimulating hormone, FSH)、促黄体生成素(luteinizing hormon，LH)、促甲状腺素(throtroid stimulating horme, TSH)共同构成的糖蛋白激素家族。由垂体分泌的促性腺激素的生成和释放受促黄体生成素释放激素(LH-RH)和促卵泡激素释放激素(FSH-RH)直接调控(图1)。作为FSH和LH的靶腺产物，性激素也同样可以通过反馈调节来影响垂体或下丘脑的分泌功能。

细胞外液中的促性腺激素与靶器官细胞表面的糖蛋白激素受体具有很强的亲和力和特异性。受体与激素的相互作用会诱导受体发生一定的构象改变，进一步来激活细胞膜相关的G蛋白偶联的信号系统。促性腺激素的受体通常认为局限于性腺细胞。而FSH受体和LH受体表达于不同的细胞，FSH受体表达于卵巢颗粒细胞和精巢的支持细胞；而LH受体存在于输卵管、大脑、子宫内膜和基层中。在卵巢中，LH受体在分化的颗粒细胞、黄体、卵泡膜细胞和精巢细胞中有所表达。大多数学者认为，促性腺激素作用于性腺的主要信使是环磷酸腺苷(cAMP)。LH和FSH受体是一组鸟苷三磷酸结合调节蛋白或G蛋白偶联在一起，这种受体可以激活蛋白激酶A系统。促性腺激素与受体形成复合物后,导致连在α亚单位上的鸟苷二磷酸被GTP替代，引起G蛋白的α亚单位从βγ复合体上解离。游离的α亚单位与腺苷酸环化酶结合，将腺苷三磷酸转变为cAMP,细胞内cAMP水平因而增加，蛋白激酶A从而被激活。在特异的丝氨酸和苏氨酸残基的磷酸化作用下，蛋白激酶A可以调节许多细胞内蛋白的功能。

图1 脑-垂体-性腺调节机制

Fig 1 Hypothalamus-Pituitary-Gonad regulating mechanism

LH和FSH通过卵巢内颗粒细胞和卵泡膜细胞，以及精巢的支持细胞和间质细胞等细胞膜表面的促性腺激素受体而发挥作用。正常情况下，LH和FSH可以相互协同来对性腺发生作用，同时还需要其他激素进行协同。FSH通过增加LH受体的数目来加强作用，曲细精管的发育从而得到刺激，进而可以参与一些激素的生成，诱导精子的发生。在卵巢中的FSH可以刺激卵泡颗粒细胞的有丝分裂，生成卵泡细胞。随着卵泡的生长，LH受体在FSH的诱导下进一步的生成，因此卵泡能和两种促性腺激素相结合，来刺激卵母细胞发育和卵子发生。来刺激卵母细胞的发育和卵巢卵泡内各种细胞的生长发育，促进卵子的成熟，活化颗粒细胞内的芳香酶，使雄激素转化为雌激素。在LH的配合下，FSH还能够促使卵泡细胞分泌其他激素。在精巢中，生精上皮发生和精子成熟受FSH的调控。LH在卵巢中可与FSH相协同，从而促进卵泡最后成熟并分泌甾体激素，触发排卵并促进黄体形成、维持其功能。LH在精巢中主要作用于间质细胞，促进睾酮的生成。在FSH的作用下，促进雄激素在精巢内的运转和增加曲细精管内睾酮含量，有利于共同发挥生精作用。促性腺激素可单独地或协同地或颉颃地作用于性腺，支配生殖细胞成熟、性激素分泌和性腺其他活动，如果没有这些促性腺激素的作用，性腺可发生萎缩[2]。脑垂体前叶促性腺激素的分泌，受丘脑下部促性腺激素释放因子的调节。另一方面，由性腺分泌的激素反过来又影响丘脑下部和脑垂体前叶的机能，因此丘脑下部、垂体前叶和性腺三者之间有着复杂的内分泌相关现象。

2 鱼类促性腺激素基因克隆研究

在早期研究中，大多数学者认为鱼类只有一种类似于LH的GtH细胞。随着对鱼类GtH研究的不断深入，20世纪80年代在大麻哈鱼(Oncorhynchusketa)中成功分离出了两种GtH，其化学性质完全不同，于是将其命名为GtHI和GthII。随后通过分子克隆和蛋白纯化，在银大麻哈鱼、金枪鱼(Thunnusthynnus)、鲤(Cyprinuscarpio)、真鲷(Chrysophrysmajor)等20余种鱼类中分离出了两种GtH，其化学结构和免疫活性成分与GtHI和GtHII类似，并有研究通过系统分析两种GtHI的β亚基编码区核酸基与哺乳动物的FSHβ亚基非常接近，GtHII的β亚基与哺乳动物的LHβ亚基接近，因此将鱼类的GtHI和GtHII分别归类为FSH激素和LH激素。它们都是以非共价键相连接的α和β两个亚基组成的二聚体结构，其中α亚基相对保守，两种激素的组成相同，而具有特异性的β亚基的氨基酸组成明显不同，具有特定的生物学作用。GtH的亚基属于半胱氨酸结家族，每一个亚基由大约100个氨基酸构成，并且包含着保守的半胱氨酸残基，这种残基通过硫键以0-或者N-L与寡糖链相连接[3]。GtHα亚基被所有脑垂体糖蛋白共享，因此在进化的过程中具有更高的选择性压力。而对于特异性的β亚基，FSH和LH的保守程度也有所不同。在褐石斑鱼(Epinephelusbruneus)体内，fshβ亚基不含有任何的N-糖基化位点，而LHβ亚基含有1个N-连接的糖基化位点[4]。在日本真鲈(Lateolabraxjaponicus)和斑马鱼(Daniorerio)中发现LH比FSH更保守，我们可以解释为在进化过程中，FSH比LH进化更加迅速[5]。另外，在不同鱼体内半胱氨酸残基的数量也有所不同。

在GtH的功能方面，研究表明，鱼类的GtH的功能与哺乳动物促性腺激素的功能十分类似。FSH主要是在鱼类性腺发育的早期，刺激性腺分泌雌二醇和睾酮等性类固醇激素，来调节性腺的发育和配子的生成，而LH则主要刺激产生17α，20β一二羟黄体酮，促使卵母细胞和精子的最后成熟及排放。还有研究表明GtH可能是通过调节芳香化酶基因的表达和芳香化酶的活性来刺激卵巢分泌雌二醇的。而GtH在体内主要受到促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)和内固醇激素的调节，研究还表明了二者对LH的分泌有联合作用。

随着分子生物技术的迅速发展，1988年快速扩增cDNA的5′和3′末端的技术随之出现。越来越多的鱼类促性腺激素基因被发现并克隆。实验方法基本相似，提取RNA后合成cDNA单链，再利用GenBank中的GtH mRNA进行引物设计，进行PCR扩增，进行3′末端和5′段扩增拼接成全长。大多数已发现并克隆的鱼类促性腺激素基因可以在GenBank中查找，如下整理了鱼类促性腺激素的NCBI搜索编号，可根据其搜索编号查询到基因全长序列。

表1 鱼类促性腺激素基因NCBI编号

鱼类促性腺激素基因的cDNA全长数量是不定的，银汉鱼(Atherinableekeri)的LH亚基cDNA长度为366 bp，而大菱鲆(Scophthalmusmaximus)的LH基因的cDNA全长为3184 bp，包含了685个氨基酸。相似物种间的同源性要远远高于不同目间的同源性，而同一物种的FSH和LH亚基之间的核苷酸、氨基酸相似度很低，尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)的LH和FSH亚基只有31.6%的核苷酸相似度和21.9%的氨基酸相似度，其LH亚基与其他的硬骨鱼类相比较，与大麻哈鱼有67%的同源性，而与褐石斑鱼有97%的同源性[6]。不属于同一目的鱼类之间的氨基酸序列变化取决于他们的系统发育。例如:鲈形目(N=7)的氨基酸序列鉴定与鲽形目(N=2)的同源性平均在82.5%,而与鳗鲡目(N=3)的同源性平均只有59.1%[7]。二级结构分析表明鳙(Aristichthysnobilis)的FSH 主要是β转角， LH B是β转角和β折叠为主，GtHα为α折叠和β转角[8]。

3 鱼类促性腺激素的定量分析

早有研究者提出假设“促性腺激素可能参与了鱼类早期的性别分化”，为验证这一假设，很多学者对促性腺激素在鱼类性腺发育的各个时期进行了表达分析。几乎所有的研究都证明了鱼类促性腺激素的二重性，其表达图谱的研究为一些硬骨鱼类的生殖功能也提供了线索。早在性腺发育的5日龄，尼罗罗非鱼的FSH和LH受体已经得到了表达[9]。随着性腺的逐渐成熟 ，LHβ基因的表达和LH激素的分泌都逐渐增加。在大菱鲆性腺发育的各个时期中，卵巢发育I期到V期间逐渐增加[10]。对于FSH的表达模式，在不同的产卵模式的硬骨鱼类中也有所不同。在银大麻哈鱼体内，FSHβ的表达开始时很低，而后逐渐增强并在产卵前达到高峰，但在产卵后迅速降低。在虹鳟(Oncorhynchusmykiss)和日本鳗鲡(Anguillajaponica)中也发现了类似的现象。而在金鱼、蓝线鳍鱼(Trichogastertrichopterus)和金头鲷(Sparusaurata)体内，FSHβ的mRNA在其性腺发育的产卵期达到峰值。在黄鳍短须石首鱼(Umbrinaroncador)体内，FSH基因在早期的卵黄发生阶段和精子发生过程中强烈表达，而LH基因在精子排放期的表达含量最高[11]。而在雌性的褐石斑鱼体内发现，所有的促性腺激素亚基的mRNA在脑垂体表达水平含量上均为:未成熟鱼体远高于成熟鱼体。并且在未成熟鱼体中，FSH亚基 的mRNA含量比GtHα亚基高出5倍，比LH亚基高出3倍。有研究探究了黄鳝(Monopterusalbus)体内的FSH和LH在不同性腺发育时期的垂体中的表达情况，性腺中FSH的表达量随着雌性到雄性的性逆转全部过程逐渐升高。这有可能意味着性腺产生的FSH在雄性精子生成过程中起着重要的旁分泌或自分泌的调控作用[12]。研究表明，经过CPE与hCG处理的花鳗鲡的LHβ和GtHα的表达量不断上调，其中发育早期GtHα的表达量极显著升高，而FSHβ的表达量呈现下调趋势，也就是说CPE与hCG的组合注射能够诱导鱼类卵巢发育成熟[13]。在花鲈体内，GtHα和LHβ亚基的表达量随着精巢发育而逐渐增加；FSHβ整体变化不大这种现象在其他鱼类中未有过报道，其原因可能是脑源的FSH不如脑源的LH与性腺发育相关性高[14]。而在性逆转过程中，LH和FSH也同样参与调控。在赤点石斑鱼体内发现，在性逆转早期(ET)阶段FSHβ 表达量处于低水平，但在性逆转后期(LT)阶段和雄性阶段表达量升高;LHβ的表达模式与FSHβ相似，但从ET阶段到LT阶段，与FSHβ相比其表达量的升高幅度较低[15]。而对黄鳝体内促性腺激素受体的研究表明，LH对诱导黄鳝卵母细胞的成熟与排放有关，FSH和LH对调节早期精巢的发育，精子的发生以及成熟具有重要作用[16]。

而在鱼类不同组织内，促性腺激素的表达量也有所不同。在史氏鲟(Acipenserschrenckii)体内发现，脑区的表达量普遍高于外周组织。FSH在脊髓中没有检测到表达，在脑垂体表达量最高；外周组织中精巢表达量最高。LH在脑区都有表达，仍然是垂体表达量最高；性腺表达量较其他外周组织高[17]。LH在大菱鲆的各个组织中，卵巢的表达含量最高，其次是肝脏，而在眼、肠道、肌肉、鳃等组织中几乎不表达。更多研究表明，鱼类的促性腺激素在脑垂体中的表达量最多，其次为性腺，而在肌肉、心脏等诸多其他组织内几乎没有表达。利用免疫组化方法在尼罗罗非鱼体内的前脑到下丘脑以及神经垂体都检测到了LH和FSH的分泌细胞。这表明了脑和脑垂体都是两种促性腺细胞的发源地[18]。在金头鲷的卵细胞中也同样可以检测到促性腺激素的分泌细胞，而在中华鳖(TrionyxSinensis)中，仅在脑垂体中表达，其他组织均未检测到表达[19]。因此可推断出在鱼类中，促性腺激素分泌细胞的存在是十分广泛的[20]。

4 鱼类促性腺激素基因重组表达

在硬骨鱼类促性腺激素功能研究障碍之一就是缺乏高纯度的激素蛋白，其解决问题的一种方法就是利用不同的生物反应器来生产激素蛋白。之前研究促性腺激素的主要方法是放射免疫测定法，随着分子生物学的发展，基因工程技术拓宽了研究促性腺激素的领域，突破了促性腺激素必须从脑垂体中纯化的限制。因而越来越多的鱼类促性腺激素基因重组表达，运用了多种表达体系。在大肠杆菌表达体系中，成功表达出了大麻哈鱼LH、草鱼(Ctenopharyngodonidella)3种促性腺激素、鲤鱼LH和FSH[20]、史氏鲟FSH和LH；而在毕赤酵母表达体系中，日本鳗鲡FSH[21]、斑马鱼FSH[22]以及罗非鱼LH[23]得到表达；变形虫表达体系中表达了非洲鲶(Silurusasotus)的FSH和LH[24]，在昆虫细胞中可以表达鲶LH和FSH[25]以及鲤GtHα亚基；在哺乳动物的细胞中表达了条纹鲈(MorontSaxatuis)FSH和LH[26]以及虹鳟LH[27]；斜带石斑鱼促性腺激素在杆状病毒-昆虫细胞表达系统中得到表达[28]，并且获得的重组蛋白具有生物学活性，经过验证可以刺激石斑鱼性类固醇激素的分泌，这一研究结果更为鱼类繁育生理学奠定了理论基础，并为水产养殖行业实践提供了理论依据与技术路线。目前的研究结果表明，硬骨鱼类的GtH的分子总量具有一定的变化范围，亚基大小的范围是14～42 ku[29]。表2是大肠杆菌表达体系中，几种硬骨鱼类蛋白的大小。表2中的3种鱼，均以新西兰大白兔作为载体制备了多抗，为进一步制备单抗，建立放射免疫测定法，为测定催产前后鱼类GtH的变化量做准备。

表2 大肠杆菌表达体系中硬骨鱼类促性腺激素亚基蛋白大小[18]

5 结语与展望

近年来，越来越多的学者关注于硬骨鱼类的促性腺激素，并取得了一定的进展，可仍然有许多问题等待着进一步探究。鱼类促性腺激素的功能和作用机制许多细节仍然不清楚，LH、FSH、GtHα亚基各自的作用机制需进一步探索。GtHα亚基的具体作用尚不明确。促性腺激素与其他激素的相互作用有待探究。促性腺激素释放激素和内固醇激素对GtH的调剂机理是十分复杂的，可能也涉及体内其他调控因子的共同作用。比如对条石鲷的研究表明，FSH调节作用可能具有更为复杂的模式，除了一种BPG轴调控方式以外，可能还有自分泌和旁分泌的调控模式，这需要进一步研究[30]。另外，对鱼类促性腺激素基因转录因子的探究还需进一步地深入。已有研究表明，单链重组的促性腺激素能够诱导精子的发生，以此为基础，可进一步探索促性腺激素对性腺的调节作用。鱼类的性别分化不仅受到遗传因素的影响，还受环境因子的调控。然而到目前为止，促性腺激素对鱼类性别分化的作用仍然缺少直接的证据。因此促性腺激素对鱼类性别分化的作用还需要进一步证实。结合离体实验和体内实验，研究促性腺激素在鱼类性腺发育与成熟中的生理功能及作用机理，完善鱼类的繁殖内分泌学理论；能否利用重组激素蛋白进行人工催产实验的研究，为鱼类人工繁殖提供一条新的催产途径更是值得关注的问题。还可以将内分泌学、发育生物学、分子生物学和生物信息学等其他学科联系起来，找到新的突破口，相信会有更大的突破。

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Research advance in gonadotropins gene in fish

LYU Shao-jin, ZHANG Tian-min, ZHAO Wen

(Key Laboratory of Hydrobiology in Liaoning Province, College of Fisheries and Life Science, Dalian Ocean University, Dalian 116021, China)

Gonadotropin plays an important role in the sexual maturation and ovulation of fishes. The controversy about the types of fish gonadotropins has come to an end after 1975. It is generally believed that there are two kinds of gonadotropin subunits, GTHI and GTHII, whose biochemical structure and biological characteristics are similar to those of the FSH and LH in the mammalian. Along with the gradual development of molecular biology, research on gonadotropin has been accrurd over the years. In this paper, authors first review the literature on the biological basis, including biochemical structure, physiological function and regulation mechanism and so on. The current research of molecular cloning of gonadotropins of teleost, the quantitative analysis and recombinant expression of gonadotropins in fishes were summarized. The purpose of this paper is to provide a valuable reference for the study on the physiology of aquaculture and to lay the foundation for further research on the mechanism of gonadotropins.

gonadotropin；gene；expression；fish

2016-10-18；

2016-11-01

辽宁省教育厅“近岸海洋生物多样性及其可持续利用创新团队”(2015)

吕绍巾，硕士研究生，研究方向为鱼类分子生物学，E-mail：ssssharky@outlook.com

赵 文，教授，博士生导师，研究方向为水域生态学,E-mail：zhaowen@dlou.edu.cn

Q78

A

2095-1736(2017)03-0082-05

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.03.082