巯基-烯点击化学法制备还原响应两亲性聚合物*

卢彦兵,谢元彬,夏迎春

(湖南大学 化学化工学院，湖南 长沙，410082)



巯基-烯点击化学法制备还原响应两亲性聚合物*

卢彦兵†,谢元彬,夏迎春

(湖南大学 化学化工学院，湖南 长沙，410082)

以胱胺二盐酸盐、氯甲酸烯丙酯、1,6-己二硫醇及端巯基聚乙二醇单甲醚等为原料，通过巯基-烯点击化学反应，合成了疏水段含二硫键的两亲性三嵌段共聚物mPEG-b-P1-b-mPEG.对mPEG-b-P1-b-mPEG在水溶液中的自组装行为进行了深入的研究.结果表明，mPEG-b-P1-b-mPEG的临界胶束浓度为0.032 mg/mL，形成胶束的平均粒径为61.3 nm.包载模拟药物尼罗红的释放行为研究表明，在D,L-二硫苏糖醇(DTT)存在的条件下，包裹在胶束中的尼罗红可以被释放出来，显示出快速的还原响应性能，表明合成的两亲性三嵌段共聚物mPEG-b-P1-b-mPEG有望作为疏水性药物载体，应用于药物控释领域.

两亲性聚合物；巯基-烯点击化学；还原响应性；胶束；药物控释

作为环境响应聚合物的一种，分子结构内含二硫键的还原响应聚合物引起了人们的关注.二硫键具有在体内血液循环过程中可以长期稳定存在,但是在存在还原剂的条件下会发生断裂.癌细胞与正常细胞相比含有大量的谷胱甘肽(GSH)，作为一种还原剂，它在癌细胞中的量足可以将二硫键还原.根据这一特性，设计研发了大量具有二硫键的还原响应性聚合物胶束[1-3].Tang等[4]合成了一种以聚磷酸酯作为亲水链段、聚己内酯作为疏水链段，中间用二硫键连接的两亲性聚合物聚己内酯-聚磷酸酯(PCL-SS-PEEP).在体外药物释放的检测中发现包载有阿霉素(DOX)的这种胶束，在10 mM GSH存在下，100 h内DOX基本全部释放完毕，而在没有GSH存在条件下，载药胶束在100 h内只释放出约40%的DOX药物.Wei等[5]通过可逆加成断裂链转移聚合(RAFT)合成了聚乙二醇-b-聚(N-羟丙基甲基丙烯酰胺)-硫辛酸(PEG-b-PHPMA-LA).两亲性聚合物PEG-b-PHPMA-LA可以在催化剂DTT(D,L-二硫苏糖醇)的作用下,发生核交联,使得形成的胶束变得更加稳定.在没有DTT的作用下,经过24 h后，没有交联的胶束的DOX释放量达到85%,而交联后的胶束的DOX释放量只有20%左右.当DTT的浓度为10 mM时,经过24 h后,交联后的胶束的DOX释放量达到90%.Liu等[6]以二硫二吡啶和1,6-己二硫醇为原料，通过缩聚反应，制备了端基为二硫吡啶、主链中含二硫键的聚合物，进而通过选择性巯基-二硫键交换反应，合成了ABA型两亲型三嵌段聚合物,对其还原响应性能进行了深入的研究，合成路线见图1.

图1 疏水聚合物P1及两亲性三嵌段聚合物mPEG-b-P1-b-mPEG的合成路线图Fig.1 Synthesis of hydrophobic polymer P1 and amphiphilic triblock polymer mPEG-b-P1-b-mPEG

本文以胱胺二盐酸盐、氯甲酸烯丙酯、1,6-己二硫醇及端巯基聚乙二醇单甲醚等为原料，通过连续的巯基-烯点击化学，将二硫键引入聚合物疏水链段，制备具有还原响应性的两亲性聚合物，对其自组装行为及聚合物胶束的还原响应性能进行深入的探索.

1 实验部分

1.1 实验原料

胱胺二盐酸盐(97%)、氯甲酸烯丙酯(分析纯)、安息香二甲醚(分析纯)、D,L-二硫苏糖醇(分析纯)及1,6-己二硫醇(98%)购自上海安耐吉试剂有限公司；端巯基聚乙二醇单甲醚(自制[7]，聚乙二醇单甲醚数均分子量2000)；其它溶剂均为化学纯.

1.2 实验方法

1.2.1 含二硫键的二烯丙基单体M1的制备

称取4.50 g(0.02 mol)胱胺二盐酸盐溶解于80 mL H2O/1,4-二氧六环混合溶剂(体积比为1∶1)中;加入13.44 g(0.16 mol)碳酸氢钠，0 ℃条件下搅拌至不再有气泡生成.用恒压滴液漏斗逐滴滴加6.03 g(0.05 mol)氯甲酸烯丙酯，室温下反应24 h之后停止反应.向溶液中加入100 mL饱和食盐水，用100 mL二氯甲烷萃取四次；萃取液经无水硫酸钠干燥后旋蒸得到无色油状物质，柱分离(二氯甲烷为洗脱剂)后得白色晶体含二硫键的二烯丙基单体M1，产率为54%.1H NMR (400 MHz，CDCl3，TMS)：δ(ppm)：2.75 (t，4H)，3.45 (m，4H)，4.5 (d,4H)，5.15 (d，2H)，5.25 (d,4H)，5.86 (m，2H).

1.2.2 端基为烯丙基的疏水聚合物P1的制备

称取合成的含二硫键的二烯丙基单体M1 0.40 g(1.25 mM)溶解于1 mL N,N-二甲基酰胺(DMF)中，加入15 mg(0.058 mM) 安息香二甲醚(DMPA)及0.156 g(1.04 mM)1,6-己二硫醇后，室温下365 nm紫外光照2 h，生成白色沉淀，停止反应.白色沉淀离心后，加入2 mL三氯甲烷将其完全溶解，再加入冰乙醚，析出白色絮状物，离心后得到棕黄色油状物质，甲醇洗涤三次后真空干燥得棕黄色的端基为烯丙基的疏水聚合物P1，产率为78%.

1.2.3 两亲性三嵌段聚合物mPEG-b-P1-b-mPEG的制备

称取合成的疏水段聚合物P1 0.1 g(0.018 mM)溶解于1 mL三氯甲烷溶中，加入0.12 g(0.056 mM)端巯基聚乙二醇单甲醚 (mPEG-SH)和15 mg(0.058 mM)DMPA，室温下365 nm紫外光照0.5 h.将溶液用去离子水透析24 h(选择截止分子量为3500 Da的透析袋，隔12 h换一次去离子水)除去三氯甲烷.得到的白色固体真空干燥后得到两亲性三嵌段聚合物mPEG-b-P1-b-mPEG 148 mg，收率为83%.

表1 疏水性聚合物P1和两亲性三嵌段聚合物mPEG-b-P1-b-mPEG的合成Tab.1 Synthesis of hydrophobic polymer P1 and amphiphilic triblock copolymer mPEG-b-P1-b-mPEG

a聚合物的数均分子量(Mn，GPC)和分散性系数(Mw/Mn)由GPC测定.b数均分量(Mn，NMR)由1H NMR测定.

1.2.4 聚合物胶束的制备

称取5 mg mPEG-b-P1-b-mPEG溶解于1 mL DMF中，快速搅拌下缓慢滴加10 mL去离子水，继续搅拌2 h.将溶液用去离子水透析24 h(选择截止分子量为3500 Da的透析袋，隔12 h换一次去离子水)除去DMF溶剂.用去离子水将聚合物溶液定容至25 mL，得到浓度为0.2 mg/mL的聚合物胶束.

1.2.5 聚合物临界胶束浓度的测定

以疏水性尼罗红为探针，采用荧光光谱法测定聚合物临界胶束浓度.取30 μL浓度为0.1 mg/mL的尼罗红四氢呋喃溶液，用微量注射器注入小玻璃瓶.在蒸干四氢呋喃后，加入4 mL的胶束溶液，胶束溶液的浓度从0.2到2×10-4mg/mL不等.然后继续搅拌溶液12 h进行荧光测试.测试激发波长为550 nm，发射光谱扫描范围为560 nm到750 nm.

1.2.6 聚合物胶束还原响应性能测试

在尼罗红浓度为1.5×10-3mg/mL的条件下，分别测试在含和不含10 mM DTT时mPEG-b-P1-b-mPEG胶束(0.2 mg/mL)的荧光发射光谱的变化

1.3 表征与测试

单体及聚合物的1H NMR核磁共振谱由INOVA-400核磁共振仪测得，以TMS为内标.嵌段共聚物的凝胶渗透色谱由Waters 1515凝胶渗透色谱仪在THF溶液中测得，使用标准聚苯乙烯为参照.荧光光谱由HITACHI F-4600荧光分光光度计在激发和发射狭缝宽度均为5.0 nm的条件下测得.透视电镜图由Tecnai G2 F20 S-twin透射电子显微镜在80 kV的条件下测得.动态光散射测试使用了Nano-ZS9电动电位和粒子分析仪.

2 结果与讨论

2.1 两亲性三嵌段聚合物mPEG-b-P1-b-mPEG的合成与表征

以胱胺二盐酸盐、氯甲酸烯丙酯为原料，合成了分子结构中含二硫键的二烯丙基单体M1，进而与1,6-己二硫醇在365 nm紫外光照下，利用巯基-烯点击化学反应，制备端基为烯丙基结构的疏水性聚合物，结果见表1.当两种单体物质的量比为1.2∶1时，通过核磁共振谱图积分面积计算得到的聚合物分子量为4.1 kDa，GPC测试结果表明聚合物的分子量呈单峰状.同样，利用巯基-烯点击化学反应，合成的端基为烯丙基的疏水聚合物P1与端巯基聚乙二醇单甲醚进行反应，制备疏水段含二硫键的两亲性三嵌段聚合物，其核磁共振谱图见图2.由mPEG-b-P1a-b-mPEG的1H NMR可以看出，单体M1及疏水聚合物P1在5～6 ppm之间的对应于双键的质子峰消失，且在3～3.5 ppm附近出现mPEG的吸收峰，表明嵌段聚合物已经成功制备.

2.2 两亲性聚合物的自组装

两亲性聚合物可以在选择性溶剂中自组装形成聚合物胶束或者囊泡等组装体.通过溶剂交换法制备了mPEG-b-P1-b-mPEG聚合物胶束，并对其自组装进行了深入的研究.

图2 单体及聚合物的1H NMR谱图Fig.2 1H NMR spectra of the monomer and polymers

从图3中可以看出，当聚合物浓度低于一定值时，尼罗红的荧光强度基本保持不变，这说明此时的聚合物浓度低于聚合物的临界胶束浓度，没有形成聚合物胶束，但是当胶束浓度超过时，荧光强度则快速增加，这表明聚合物溶液浓度达到了聚合物的临界胶束浓度，尼罗红被包裹在了胶束的疏水区域内.图3(b)中，交点所对应的胶束浓度就是两亲性三嵌段共聚物mPEG-b-P1-b-mPEG的临界胶束浓度，为0.032 mg/mL.

采用TEM和DLS对两亲性三嵌段共聚物mPEG-b-P1-b-mPEG胶束的形貌以及平均粒径进行了测试.TEM测试结果显示，聚合物胶束为球型，平均粒径为50 nm左右.而DLS测试聚合物胶束的平均粒径是在61.3 nm，胶束粒径分布较窄，PDI为0.216.两种测试中胶束平均粒径的差异主要是由于TEM测试制样过程中，胶束外壳PEG在干燥时失水收缩，导致胶束的平均粒径小于在其水溶液中的平均粒径[8～10].

2.3 聚合物胶束的还原响应性研究

由于疏水链段主链结构中含可被还原而断裂的二硫键，利用DLS对两亲性mPEG-b-P1a-b-mPEG胶束在加入还原剂DTT后的粒径变化进行了测试，结果见图3(d).由图3(d)可以看出，在加入DTT后，聚合物胶束的粒径迅速变小，2 h和5 h时聚合物胶束的平均粒径分别减小为31.1 nm和21.5 nm.这主要是由于DTT存在时，聚合物主链的二硫键被还原而发生断裂，使得聚合物胶束结构被破坏.

图3 两亲性三嵌段聚合物mPEG-b-P1a-b-mPEG聚合物胶束的表征Fig.3 Characterization of the amphiphilic triblock polymer mPEG-b-P1a-b-mPEG micelles

为进一步考察mPEG-b-P1a-b-mPEG聚合物胶束的还原响应性能及其在药物控释领域的应用可能性，对包载模拟药物尼罗红分子的聚合物胶束在DTT存在下的释放行为进行了研究.如图4所示，无DTT存在时，尼罗红的荧光强度缓慢下降.而DTT存在时，由于疏水链段主链中的二硫键断裂，聚合物胶束被破坏，尼罗红分子被释放进入水溶液中，荧光强度迅速下降，12 h时荧光强度减小40%左右， 48 h时荧光强度保持在20%左右.结果表明，所合成的两亲性三嵌段共聚物mPEG-b-P1a-b-mPEG胶束具有良好的还原响应性能，可在还原剂存在时快速释放所包载的疏水性药物.

图4 DTT存在或不存在时尼罗红的还原响应释放行为Fig.4 Reduction-triggered Nile Red release profiles in aqueous solution with and without DTT.

3 结 论

利用巯基-烯点击化学反应制备了具有还原响应的两亲性三嵌段共聚物mPEG-b-P1-b-mPEG，对其结构、自组装行为以及还原响应性能进行了深入的研究.结果表明，mPEG-b-P1-b-mPEG具有较低的临界胶束浓度，在水中自组装形成的球形胶束的平均粒径为61.3 nm.在DTT存在的条件下，包载在胶束中的尼罗红可以被快速释放，48 h时释放率可达80%.这类具有还原响应的聚合物胶束有望用作聚合物药物载体，有效地运输和释放疏水性药物.

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Synthesis of Reduction-responsive Amphiphilic Copolymer by Thiolene Click Chemistry

LU Yanbing†，XIE Yuanbin，XIA Yingchun

(College of Chemistry and Chemical Engineering，Hunan University，Changsha 410082,China)

Amphiphilic triblock copolymer mPEG-b-P1-b-mPEG,with disulfide bond in the main chain of the hydrophobic block,was prepared from cystamine dihydrochloride,allyl chloroformate,1,6-hexanedithiol and monomethoxy poly (ethylene glycol) with a thiol end group through thiolene click chemistry method. Self-assembly of the obtained mPEG-b-P1-b-mPEG was further investigated. The results showed that the critical micelle concentration of the amphiphilic block polymer was 0.032 mg/mL,and the average diameter of the micelle was about 61.3 nm. The loaded model drug Nile Red could be released from the micelles in the presence of DTT,indicating the reduction responsiveness of the obtained amphiphilic copolymer. Therefore,these findings suggested the potentials of the amphiphilic copolymers as smart intracellular drug delivery systems.

amphiphilic polymer;thiol-ene click chemistry;reduction responsiveness;micelle；controlled drug deeivery

1674-2974(2017)06-0096-05

10.16339/j.cnki.hdxbzkb.2017.06.016

2016-05-17

卢彦兵(1976—),男，河南鄢陵人，湖南大学副教授，博士生导师†通迅联系人，E-mail:yanbinglu@hnu.edu.cn.

O633.3

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