不同分子质量区间的麦胚肽抗过敏活性研究

纪小国，黄继红,2*，杨铭乾，李海月，赵 祎，毕振原

（1.河南工业大学 生物工程学院，河南 郑州 450001；2.河南省食品工业科学研究所有限公司，河南 郑州 450000）

不同分子质量区间的麦胚肽抗过敏活性研究

纪小国1，黄继红1,2*，杨铭乾1，李海月1，赵 祎1，毕振原1

（1.河南工业大学 生物工程学院，河南 郑州 450001；2.河南省食品工业科学研究所有限公司，河南 郑州 450000）

碱性蛋白酶水解麦胚所获得的肽类混合物有较高的生物活性。采用超滤法对麦胚肽进行分离，对不同分子质量区间的小肽进行抗过敏活性研究。结果表明，分离麦胚肽的最佳超滤工艺条件为：操作压力为0.4 MPa，料液质量浓度为 16 mg/mL（10 ku和 5 ku膜）或 20 mg/mL（1 ku膜），周期为1 h；麦胚酶解液经全质谱鉴定，主要为5 107种不同种类的肽段，建立了简易麦胚肽数据库；麦胚肽体外抗过敏活性结果表明，其抗过敏活性与小肽的分子质量大小呈负相关，分子质量小于1 ku的组分表现出最大的透明质酸酶抑制率，达到82.5%，IC50约为0.87 mg/mL。生物信息学技术结合质谱分析麦胚肽抗过敏活性位点可能为麦胚肽C端的甘氨酸结构域，通过调节Th2细胞的分化异常和改变靶细胞细胞膜通透性来实现麦胚肽的抗过敏功能。

麦胚肽；超滤法；抗过敏；甘氨酸结构域

0 前言

活性肽是指一类具有特殊生理活性的氨基酸序列，氨基酸数一般小于20个，分子质量6 000 u以下，而决定其活性的关键是所含氨基酸的种类及其排列顺序[1]。活性肽的生理功能主要有激素活性、调节激素功能、神经活性、提高免疫力、抗氧化、延缓衰老、抗菌、抗过敏、改善和提高矿物质运输、抗肿瘤等[2]。小麦胚芽营养成分复杂，仅从蛋白质角度考虑，除含量丰富的清蛋白和球蛋白外，还有含量较高的醇溶蛋白、谷蛋白和谷胱甘肽等成分。大量研究发现，采用酶法水解麦胚所获得的肽类混合物有较高的抗氧化、抗肿瘤、降血压、抗炎及增强免疫力等功能，具有良好的药用价值[3-4]。

目前，国内外学者通过酶解制备麦胚活性肽，并对其生物活性进行了研究，如王才立等[4]研究发现，麦胚酶解液在降血压、抗氧化方面具有较高的活性。同时学者们还发现麦胚肽也具有一定的抗菌和降胆固醇功能，如杨阳[5]采用保温孵育的方法制备了麦胚抗菌肽，并对其进行了富集和纯化；陈雪等[6]优化了麦胚降胆固醇肽的酶解工艺等。马涛等[7]对多种食源性低聚肽进行抗过敏活性研究，结果发现小麦肽的抗过敏活性最高。作者以脱脂麦胚为研究对象，采用超滤技术结合生物信息学手段对其进行分离富集，研究不同分子质量区间麦胚肽的抗过敏活性及其机制，为具有抗过敏活性的麦胚肽提供了一个可工业化生产的方法，大大拓宽了麦胚资源的综合利用途径。

1 材料与方法

1.1 材料

脱脂麦胚：郸城财鑫糖业有限公司；碱性蛋白酶（20万 U/g）：Solarbio公司；透明质酸酶（500 U/g）：Sigma公司；透明质酸钠：Solarbio公司；三氟乙酸(TFA)：Fluka 公司。

1.2 仪器与设备

723N可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；UV-1000紫外分光光度计：天美（中国）科学仪器有限公司；实验型膜分离设备（双工位平板膜）：赛普（无锡）膜科技发展有限公司；LTQ Velos双压线性离子阱质谱仪：Thermo Finnigan，San Jose，CA；Zorbax 300SB-C18 peptide traps 柱：Agilent Technologies,Wilmington,DE。

1.3 方法

1.3.1 麦胚肽的制备

参照Diao等[8]的方法利用碱性蛋白酶制备麦胚肽。

1.3.2 麦胚肽的超滤分离

将所制备酶解液依次通过截留分子质量为10、5、1 ku的超滤膜进行分级分离，并考察操作压力、料液质量浓度及超滤时间对膜通量的影响，确定最佳超滤工艺。

1.3.3 麦胚肽的含量测定

采用酸溶性肽含量测定法[9]。

1.3.4 麦胚肽的质谱分析

参照He等[10]的方法对制备的麦胚肽进行质谱分析。

1.3.5 麦胚肽的体外抗过敏活性的测定

透明质酸酶体外抑制试验采用Elson-Morgan法[11]，并做适当修改。样品空白对照组溶液经440～700 nm波长范围扫描，此波长区间内出现一个波峰和一个波谷，在波峰处显色物质的吸光值最大，此时波长为535 nm。选择麦胚肽的体外透明质酸酶抑制试验的测定波长为535 nm。

1.3.6 数据处理

试验数据均为3个平行数据的均值，用分析系统软件SPSS.20和Origin 8.5软件进行处理。

2 结果与分析

2.1 最佳超滤工艺条件的确定

2.1.1 超滤压力对膜通量的影响

以操作压力为变量，在相同时间内，对质量浓度为20 mg/mL的麦胚酶解液进行超滤分离，考察压力对超滤膜通量的影响，结果如图1所示。在相同压力条件下，截留分子段为10 ku超滤膜的膜通量最小，并随着截留分子质量的减小而逐渐增大。随着操作压力的不断增大，不同截留分子段的超滤膜的膜通量均出现先快速增大，后增幅放缓的现象。在较小的压力范围内（＜0.4 MPa），膜通量较小，处于压力控制阶段，几乎不受膜表面浓差极化现象的影响；而当压力持续增大（＞0.4 MPa）时，浓差极化现象显著，界面浓度差成为影响膜通量的主要因素，处于传质控制区[12]。在压力达到0.4 MPa后，膜表面呈现凝胶层，且随压力增大而增厚，持续加大的压力将会与凝胶层阻力相抵，并不能成为增大膜通量的助力。因此选择0.4 MPa为最适操作压力。

图1 操作压力对膜通量的影响Fig.1 Effect of operating pressure on membrane flux

2.1.2 料液质量浓度对膜通量的影响

由图2可知，在0.4 MPa的操作压力下，将不同质量浓度的酶解液超滤分离相同的时间后，不同截留分子质量的超滤膜表现出不一样的膜通量。截留分子质量10 ku的膜的通量依旧最小，且受料液浓度影响较大；而截留分子质量1 ku的超滤膜则与之相反。对于截留分子质量为10 ku和5 ku的超滤膜，选择16 mg/mL为最佳浓度；而对于1 ku的截留膜，选择20 mg/mL为最适的膜分离浓度。

图2 料液质量浓度对膜通量的影响Fig.2 Effect of feed mass concentration on membrane flux

2.1.3 超滤时间对膜通量的影响

由图3可知，在0.4 MPa的操作压力下，将质量浓度20 mg/mL的麦胚酶解液依次通过10、5、1 ku的超滤膜，进行不同时间的超滤分离，发现超滤时间是影响超滤膜通量的重要因素。如图3所示，截留分子质量分别在10、5、1 ku的超滤膜膜通量均在1 h后趋于稳定。为提高超滤效率，选择1 h为一个运行周期。

图3 超滤时间对膜通量的影响Fig.3 Effect on ultra-filtration time on membrane flux

2.2 麦胚肽的分布情况

图4为麦胚酶解液经过不同截留分子段的超滤膜后各截留分子段中麦胚肽的含量。通过1 ku超滤膜的组分中肽含量最高，截留分子段大于10 ku、5～10 ku和1～5 ku组分的肽含量较为接近，均处于较低水平。取蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量为120 u，则透过10 ku和5 ku的超滤膜的组分的平均肽链长度在42个氨基酸以上，以多肽为主；而截留分子质量在5 ku以下的组分肽链相对较短，以相对分子质量小于1 ku（平均链长在8个氨基酸以下）短肽和游离氨基酸为主，约占72%。由此可见，短肽和游离氨基酸为碱性蛋白酶水解麦胚蛋白后的主要成分。

图4 麦胚酶解液中不同分子质量肽段的含量分布Fig.4 The distribution of peptides with different molecular weight in enzymatic hydrolysate of wheat germ

2.3 麦胚肽的质谱分析

脱脂麦胚经碱性蛋白酶水解后的多肽混合物通过LC-MS/MS分析，得到麦胚酶解液的总离子流色谱图（图5）。根据质荷比和保留时间绘制而成，用来反映样品的色谱分离度、肽段信号强度、样品小肽构成的复杂程度等信息。不同时间洗脱的峰较多，相对丰度较高，说明麦胚肽样品肽段种类丰富，复杂程度高。

图5 麦胚酶解液的总离子流色谱图Fig.5 Total ion current chromatogram of enzymatic hydrolysate of wheat germ

通过质谱结合Uniport数据库，建立了麦胚肽的简易数据库，包括5 107种不同种类的小肽及其氨基酸序列、分子质量、等电点等信息，为生物活性肽的筛选和构效关系研究奠定了基础。分子段1 ku以下的麦胚肽236种、1～5 ku的小肽3 802种、5～10 ku的麦胚肽95种、10 ku以上的974种。其中1～5 ku分子段的麦胚肽种类最为丰富，根据小肽的氨基酸组成分析，1 ku以下的麦胚肽中特有的甘氨酸结构域，可能会影响其抗过敏活性。如Kim等[13]从病人的血清中分离出了具有富含甘氨酸的抗过敏活性肽段 LVAHVGAGGVL、RVSSCRGRNHIV、GFWCRRSGLVGV，可以显著地抑制抗原刺激的肥大细胞的组胺释放，同时也可以降低大鼠嗜碱性粒细胞β-己糖胺酶的释放，减轻细胞内钙离子的升高。

表1 碱性蛋白酶酶解的麦胚肽的分子段分布Table 1 Molecule weight distribution of wheat germ peptides of alkaline protease enzymolysis

2.4 麦胚肽抗过敏活性结果分析

如图6a显示，在相同浓度条件下，随着分子质量的减小，麦胚肽的透明质酸酶体外抑制活性呈增高趋势，其中分子段小于1 ku的组分的抑制率明显高于其他两组分，抑制率达到82.5%。对于不同浓度的麦胚肽组分，分子质量在1～5 ku和5～10 ku时，其抗过敏活性随浓度的变化不明显，且在较高浓度时的抗过敏活性仅为18%和9%。以上结果显示，分子质量小于1 ku的麦胚肽的抗过敏活性较高，其抗过敏活性和分子质量大小、分子段内的小肽种类有密切关系。

图7为分子段小于1 ku的麦胚肽的抗过敏活性与其浓度间的量效关系。在质量浓度小于0.8 mg/mL时，抗过敏活性随其浓度的升高而快速增加；随着浓度持续增大，活性的上升趋势有所下降，并在1.2 mg/mL时逐渐趋于平稳，此时透明质酸体外抑制率达81.09%。SAS分析显示该分子质量段的 IC50为（0.87±0.14）mg/mL，说明分子质量小于1 ku的麦胚肽具有较强的抗过敏活性。另外，将图7中数值进行多项式回归分析，得到回归方程：y=-28.404 02x2+98.058 04x-1.982 14；R2=0.986 04。相关系数R为0.993 0，方程可信度较高，能够较好地解释小分子麦胚肽（＜1 ku）抗过敏性的剂量-效应关系。

图6 麦胚肽超滤组分的体外透明质酸酶抑制活性Fig.6 The hyaluroniuse inhibition rate of ultrafiltration components of wheat germ peptides in vitro

图7 麦胚肽超滤组分（＜1 ku）的体外透明质酸酶抑制活性Fig.7 The hyaluroniuse inhibition rate of ultrafiltration components of wheat germ peptides（＜1 ku）in vitro

生物分子的活性与结构密切相关，对一种大分子物质进行功能性研究，确定其分子结构并利用分子的结构特征与相应生物活性之间的关系，找出结构和生物学活性之间的定量关系来预测新化合物的活性已逐渐成为活性肽研究的主流。

根据质谱结果，对分子质量小于1 ku的麦胚肽进行检索，得到具有富含甘氨酸结构域的典型肽段的信息如表2所示。可以看出，小于1 ku的麦胚肽的末端（C端）氨基酸多为甘氨酸，其序列中富有甘氨酸。可见麦胚肽的抗过敏活性和其富含的甘氨酸结构域及末端氨基酸密切相关。对麦胚肽的抗过敏的活性有如下解释：（1）Gly分子质量小,不具有侧链,小肽中的高含量Gly，尤其是一对Gly的存在能够增强肽链的弹性、形成多变的空间结构对其抗过敏活性可能有重要的作用。（2）富含Gly的小肽通常带有净的正电荷,这使得它们能影响抗体蛋白和靶细胞的细胞膜的相互作用，使其细胞膜和抗体蛋白的结合力降低，从而减轻过敏反应的症状。如分子质量在20 ku左右的动物源性攻击素，在溶液中呈现无规则卷曲结构。攻击素通过与脂多糖的相互作用，抑制外膜蛋白质的合成，影响细胞膜和IgE蛋白的结合[14]。（3）植物中典型活性肽富含甘氨酸的重复域、β-折叠以及形式灵活的螺旋结构，富含甘氨酸的重复域能够使得小肽具有很高的灵活性，并且在蛋白质和脂质相互作用时形成扣式结构域，结构域周围伴随着 Try、His、Arg、Asn 和 Glu，影响活性肽的疏水性。植物中富含甘氨酸的蛋白质或多肽是植物的防御及修复系统的主要作用因子，对于动物的免疫系统有类似的效果。分子段小于1 ku的麦胚肽结构信息表明，可能通过特殊的甘氨酸结构域改变靶细胞细胞膜的通透性和修复免疫系统异常来影响其抗过敏活性。

表2 可能具有抗过敏活性的典型肽段信息Table 2 The information of peptides with ant-allergic activity

过敏反应主要通过抗原（致病源）进入机体后与附着在肥大细胞和嗜碱性粒细胞上的 IgE分子结合，并触发该细胞释放生物活性物质，引起临床表现和病理变化[15-17]。过敏反应有两个关键位点:（1）麦胚肽可能通过特有的甘氨酸扣式结构域对机体的免疫系统进行修复，调节Th2细胞的分化异常。（2）麦胚肽特有的结构可能通过影响肥大细胞和嗜碱性粒细胞细胞膜的通透性，降低IgE分子的结合效率，减少活性物质的释放，降低机体的过敏反应。麦胚肽的抗过敏作用呈现出多层次、多靶点的特点，可能在调节Th2细胞的分化异常、抑制免疫球蛋白 IgE产生、改变靶细胞膜通透性等多个环节中起作用，具体的作用机理还需要进一步研究。

3 结论与展望

以脱脂麦胚为原料进行麦胚肽制备，在超滤分离富集的基础上分析了不同分子段的抗过敏活性和剂量关系，探讨其抗过敏活性机制，得出如下结论：（1）超滤工艺对麦胚肽具有较好的分离富集效果，麦胚肽的主要成分为短肽,分子质量小于1 ku的组分表现出最大的透明质酸酶抑制率，并具有一定的剂量相关性；（2）建立包含5 107种肽段的麦胚肽的简易数据库，选取具有典型结构的麦胚肽，分析得出麦胚肽抗过敏活性和甘氨酸结构域有关。

超滤技术分离富集得到的麦胚肽表现较强的抗过敏活性，但是分离机制主要依靠分子排阻技术，而该分离手段还不足以达到预期的效果，麦胚肽活性的大小与其分子质量、氨基酸组成、首末端氨基酸、二级结构等关系密切；后续的研究准备利用具有高度的专一性、选择性的分子印迹技术作为新型的分离手段，得到单一的肽段进一步分析。本文是依据前期课题组优化的碱性蛋白酶酶解麦胚肽的基础[8]，用质谱解析了可能存在的抗过敏肽，有必要继续对这些肽段进行逐一抗过敏活性研究。麦胚活性肽的制备及性质研究可以有效提高麦胚资源的综合利用率，为高生物活性肽的制备提供了新方法，同时也可为功能性保健品及药品原料的开发提供借鉴。

［1］ 孙宏.菌酶协同处理棉籽粕的营养特性、棉籽肽的制备及其抗氧化活性研究［D］.杭州：浙江大学，2013.

［2］ 龚建苗，陈庆森，阎亚丽，等.生物活性肽调节NF-κB信号通路的研究进展［J］.食品科学，2013，21（34）:379-388.

［3］ 刘光明，刘庆梅，徐莎莎，等.食物抗过敏的天然活性物质研究进展［J］.中国食品学报，2016，16（3）:13-22.

［4］ 王才立，张志国，王成忠，等.不同分子质量小麦胚芽多肽的体内抗氧化活性［J］.食品科学，2013，34（7）:275-278.

［5］ 杨阳.麦胚抗菌肽富集与分离纯化技术研究［D］.南京：南京农业大学，2011.

［6］ 陈雪，王雪，张丽萍.制备麦胚降胆固醇肽的水解条件优化［J］.黑龙江八一农垦大学学报，2012，24（6）:46-52.

［7］ 马涛，林峰，林单，等.食源性低聚肽抗过敏活性研究［J］.食品科技，2014，39（2）:27-30.

［8］ DIAO D P，HUANG J H，FENG J W，et al.The technology research of anti-oxiution peptide preparation by alkaline protease hydrolyzing wheat germ meal［J］.Agricultural Science and Technology，2014，15（2）:182-186.

［9］ 王珊珊.鳕鱼骨胶原肽与活性钙的制备及其抗骨质疏松活性研究［D］.青岛：中国海洋大学，2013.

［10］ HE D，HAN C，YAO J，et al.Constructing the metabolic and regulatory pathways in germinating rice seeds through proteomic approach［J］.Proteomics ，2011，11（3）:2693－2713.

［11］李杨，董银卯，孟宏，等.7种中草药提取物抗过敏功效及刺激性研究［J］.中国实验方剂学杂志，2013，19（4）:191-194.

［12］田少君，焦宝利，毛小平，等.大豆肽的超滤分离及其清除自由基活性研究［J］.中国油脂，2015，40（4）:18-21.

［13］ KIM K，KIM Y H，RO J，et al.Inhibitory mechanism of anti-allergic peptides in RBL2H3 cells［J］.European Journal of Pharmacology，2008，581（12）:191-203.

［14］LIU Q M，WANG Y Z，CAO M J，et al.Anti-allergic activity of R-phycocyanin from Porphyria haitanensis in antigen sensitized mice and mast cells［J］.International Immunopharmacology，2015，25（2）:465-473.

［15］KO S，LEE D，PARK W，et al.Anti-allergic effects of a nonmetric peptide isolated from the intestine gastrointestinal digests of abalone（Haliotis discus hannai） in activated HMC-1 human mast cells［J］.International Journal of Molecular Medicine，2015，37（1）:243-250.

［16］SONG M，PARK D K，CHO M，et al.Antiinflammatory and anti-allergic activities of sea cucumber （Stichopus japonicus）extract［J］.Food Science and Biotechnology， 2013， 22（6）:1661-1666.

［17］顾媛媛，张丹丹，冯程，等.基于 UPLC-QTOF-MS技术的牛血清白蛋白诱导过敏反应的代谢组学研究［J］.中国中药杂志，2016，41（21）:4029-4035.

ANTI-ALLERGIC ACTIVITY OF WHEAT GERM PEPTIDES WITH DIFFERENT MOLECULAR WEIGHT RANGE

JI Xiaoguo1， HUANG Jihong1，2， YANG Mingqian1， LI Haiyue1， ZHAO Yi1， BI Zhengyuan1
（1.School of Biological Engineering，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001，China；2.Food Industry Research Institute of Henan Province，Zhengzhou 450000，China）

Active peptide is a kind of amino acid sequence with special physiological activity，of which the number of amino acids is generally less than 20，molecular weight of 6 000 u or less，and the key factor determine its activity is the type of amino acids and their arrangement.The peptide mixture obtained by alkalineprotease hydrolysis of wheat germ has high biological activity.The wheat germ peptides were separated and enriched by ultra-filtration method in this study，and the anti-allergic activity and structure-function relationship of these peptides fragments were analyzed.The result showed that the optimized ultra-filtration conditions of separating the wheat germ peptides were as follows:time of 1 h，pressure of 0.4 MPa，temperature of 25℃ and the filtrate concentration of 16 mg/mL （10 ku and 5 ku）or 20 mg/mL （1 ku）.After ultra-filtration，the constituents were identified by mass spectrometry，which revealed that 5 170 kinds of different peptide fragments were included accounting for more than 72%.Meanwhile，the simple database of the peptides of wheat germ was set up.The result of the anti-allergic activity demonstrated that the ant-allergic activity of these peptides fragments had negative correlation with the molecular weight.These fragments with molecular weight less than 1 ku had the highest inhibition ratio of 82.5%，while the IC50was 0.87 mg/mL.C-terminal glycine structural domain of small peptide was proved to be the active site of anti-anaphylaxis by bioinformatics techniques combined with mass spectrometry analysis.The anti-anaphylaxis of wheat germ peptides was realized by regulating of the prosoplasia of the Th2 cell and changing the membrane permeability of target cell.This study will not only provide a considerable measure to separate wheat germ peptides for food industry but also supply the reference for the development of functional health food and pharmaceutical raw materials.

wheat germ peptides；ultra-filtration；anti-anaphylaxis；structural domain of glycine

TS201；TQ464.7

B

1673-2383(2017)03-0031-07

http://kns.cnki.net/kcms/detail/41.1378.N.20170621.1050.012.html

网络出版时间：2017-6-21 10:50:32

2016-09-03

河南工业大学谷物资源转化与利用省级重点实验室开放课题（001254）；河南省国际科技合作与交流项目（152102410032）；郑州市国际科技合作与交流项目（141PGJHZ546）

纪小国（1993—），男，河南周口人，硕士研究生，研究方向为微生物学。

*通信作者