高效液相色谱法测定粮谷类中脱氧雪腐镰刀菌烯醇

王丽君，禹洁，苏阿龙，贾红芳，朱书强*

（甘肃省食品检验研究院，甘肃兰州730030）

高效液相色谱法测定粮谷类中脱氧雪腐镰刀菌烯醇

王丽君，禹洁，苏阿龙，贾红芳，朱书强*

（甘肃省食品检验研究院，甘肃兰州730030）

利用纯水溶解提取粮谷类样品中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇，经过免疫亲和柱净化，并优化提取净化条件，通过高效液相色谱检测其含量。结果表明，采用2 mL滤液上样，经氮吹仪在40℃吹干后，用1 mL乙腈-水（20∶80，V/V）定容，在波长220 nm条件下进行检测，色谱峰分离效果良好。脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量在20～500 ng/mL范围内线性关系良好（R2=0.999 8），检出限2 μg/kg，精密度试验结果相对标准偏差（RSD）值为2.4%，回收率为87.6%～98.9%，RSD值为2.04%～2.68%，表明该方法具有良好的精密度和准确性，适用于粮谷类样品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量的定量分析检测。

脱氧雪腐镰刀菌烯醇；粮谷类；免疫亲和柱；高效液相色谱

脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）是镰刀菌属（Fusarium）产生的一种B型单端孢霉烯族真菌毒素，对动物和人都具有很强的致呕吐能力，因此又被称为“呕吐毒素（vomitoxin）”[1]。其主要存在于小麦、大麦、燕麦、黑麦、玉米、大米等谷物及其制品中，在全球范围内具有很高的污染率[2]。DON既能引起急性中毒也可造成慢性损害。动物急性中毒主要表现为呕吐、拒食、体质量降低和腹泻，人群DON急性中毒症状包括恶心、呕吐、胃肠紊乱、头晕、头痛和腹泻，慢性中毒表现为摄食减少、生长缓慢及血清免疫球蛋白水平改变[3]。因此建立DON的分析检测方法，对于粮谷类食品中DON的暴露和风险评估具有重要意义。

目前对脱氧雪腐镰刀菌烯醇的检测方法主要有薄层色谱法（thin layer chromatography，TLC）、高效液相色谱法（highperformance liquidchromatography，HPLC）、柱净化法结合电子捕获检测器的气相色谱法（column purification methodcombinedwithelctroncapturedetectorgaschromatography，GC-ECD）、高效液相色谱串联质谱法（high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLCMS/MS）、放射性免疫测定法（radioimmunoassays，RIAs）等[4-9]；马冬月等[10]采用酶联免疫（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法分别检测了小麦、大麦、燕麦、黑麦、玉米、大米等谷物中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇，检测结果回收率低，不能准确定量。游淑珠[11]提出了采用乙腈-水提取粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇，以用N-七氟丁酰咪唑衍生，GC-ECD检测；唐吉旺等[12]提出谷物样品经乙腈-水溶液提取，离心后经自制中性氧化铝-活性炭-二氧化硅固相萃取柱净化，气相色谱检测；李华[13]提出了酶联免疫吸附的测定方法；张鹏等[14]提出了采用免疫亲和柱（immunoaffinity column，IAC）或多功能净化柱（multifunctional purification column，MFC）净化，用高效液相色谱法检测。上述方法前处理步骤繁琐，分析时间长，试验成本高，提取效率低，灵敏度和特异性差，结果存在一定的假阳性，不能准确地定量。因此，本研究采用免疫亲和柱净化，建立高效液相色谱检测粮谷类中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的方法，以期为快速准确地测定粮谷类样品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇提供技术方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米粉样品、啤酒大麦、小麦粉、粮谷制品：市售；脱氧血腐镰刀菌烯醇标准液（质量浓度100 μg/mL）：上海酶联生物有限责任公司；甲醇（色谱纯）：北京百灵威科技有限责任公司；氯化钠（分析纯）天津新沃化工有限责任公司；磷酸氢二钠（分析纯）：北京康普汇维科技有效责任公司；氯化钾（分析纯）：武汉兴众诚科技有限公司；盐酸（分析纯）：河北固安清远化工试剂厂；聚乙二醇（纯度＞99%）：天津中和盛泰化工有限责任公司；玻璃纤维滤纸（直径11cm，孔径1.5 μm）：杭州沃华滤纸有限公司。

1.2 仪器与设备

Waters e2695高效液相色谱仪（配有紫外检测器）：美国沃特世公司；H1650型离心机：长沙湘仪科技有限责任公司；Vortex-Genie涡旋仪：艾卡（广州）仪器设备有限公司；1 250 ng/3 mL脱氧血腐镰刀菌烯醇免疫亲和柱：ROMER国际贸易（北京）有限公司；AccuPrep SPE48位高通量正压固相萃取仪：美国J2 Scientific公司；GenPure UV-TOC/UF× CAD plus超纯水器：赛默飞世尔科技有限责任公司。

1.3 方法

1.3.1 标准曲线的绘制

取1.00 mL 100 μg/mL脱氧血腐镰刀菌烯醇标准储备液于10 mL容量瓶中，用乙腈+水（2+8）定容，得到10 μg/mL脱氧血腐镰刀菌烯醇标准中间液。分别吸取标准中间液0.20 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、5.00 mL于10 mL容量瓶中，用乙腈-水（20∶80，V/V）定容，摇匀后得到质量浓度分别为20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL的脱氧血腐镰刀菌烯醇标准系列工作液，经0.45 μm过滤后，采用高效液相色谱仪检测，以脱氧血腐镰刀菌烯醇标准工作液质量浓度（x）为横坐标，色谱峰面积（y）为纵坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线回归方程。

1.3.2 样品前处理方法

准确称取粮谷类样品25 g于100 mL离心管中，加入80 mL超纯水，高速涡旋5 min，超声提取30 min，加水定容至100 mL，静置10 min，用玻璃纤维滤纸过滤，滤液备用。将脱氧雪腐镰刀菌烯醇免疫亲和柱放置至室温，顶部连接一支30 mL注射器，置于高通量正压固相萃取仪上，取2 mL滤液于30 mL注射器内，控制流速1滴/s的速度通过免疫亲和柱。用5 mL磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered solution，PBS）和5mL去离子水先后淋洗免疫亲和柱。直至空气进入亲和柱中，弃去全部流出液，抽干小柱。准确加入3 mL甲醇洗脱，流速控制在1滴/s，收集流出液于10 mL离心管中，40℃氮气保护吹干，用1 mL乙腈-水（20∶80，V/V）溶解，经0.45 μm过滤后，待高效液相色谱仪测定[15-16]。

1.3.3 高效液相色谱条件

色谱柱：Waters C18色谱柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）；流动相：乙腈-水（20∶80，V/V）等度洗脱；柱温：30℃；流速：1.0 mL/min，检测波长：220 nm，进样量50 μL。

2 结果与分析

2.1 样品的提取与净化柱的选择

[17]报道，粮谷类中脱氧雪腐镰刀菌烯醇大多采用纯水或甲醇水提取，提取液经免疫亲和柱净化，但甲醇毒性大，损害人体健康，且对环境有危害。本试验采用纯水提取，在涡旋仪上高速涡旋5 min，超声提取30 min，提取液分别用硅胶柱和经有脱氧雪腐镰刀菌烯醇特异抗原的免疫亲和柱净化，结果表明特异抗原的免疫亲回收率高，特异性强。

2.2 上柱体积的优化

在粮谷类样品中加入不同体积（0.5 mL、1.0 mL、5 mL）的10 μg/mL脱氧血腐镰刀菌烯醇标准溶液，使样品中脱氧血腐镰刀菌烯醇的含量分别为1ng/mL、10ng/mL、50ng/mL，按照1.3的方法测定其含量，并计算回收率，评价试验效果。考察上柱体积对回收率的影响，结果见表1。由表1可知，上柱体积为1.0mL时，回收率为56.01%～60.10%；上柱体积为2.0 mL时，回收率为95.62%～100.81%；上柱体积为5.0 mL时，回收率为64.21%～74.32%；上柱体积为10.0 mL时，回收率为50.32%～60.32%。因此，本实验最终采用上柱体积为2.0 mL。

表1 上柱量优化结果(n=4)Table 1 Optimization results of sampling volume(n=4)

2.3 色谱条件的优化

脱氧雪腐镰刀菌烯醇是极性化合物，流动相以水作为基础溶剂，在波长190～400 nm范围内进行全波长扫描，脱氧雪腐镰刀菌烯醇在波长220 nm处有最大吸收。且杂峰和基线噪音干扰少。通过上述优化的方法，采用乙腈-水（20∶80，V/V）作为流动相时，考察对色谱分离效果的影响，对脱氧血腐镰刀菌烯醇标准品及样品进行检测，检测结果见图1。由图1可知，在该色谱条件下，目标物色谱峰目标峰与样品杂峰分离良好，色谱峰形尖锐对称，没有产生拖尾及前沿等现象。且采用乙腈-水（20∶80，V/V）为流动相时，流动相的配比简单，毒性小。

图1 脱氧血腐镰刀菌烯醇标准品（A）及样品（B）高效液相色谱图Fig.1 HPCL chromatogram of deoxynivalenol standard substance (A)and the sample(B)

2.4 方法学考察

2.4.1 标准曲线的建立

采用上述优化的色谱条件对脱氧血腐镰刀菌烯醇标准工作液进行检测，以脱氧血腐镰刀菌烯醇标准工作液质量浓度（x）为横坐标，色谱峰面积（y）为纵坐标，绘制标准曲线，脱氧血腐镰刀菌烯醇标准曲线线性回归方程、相关系数、检出限（limit of detection，LOD）结果见表2。

表2 脱氧血腐镰刀菌烯醇线性回归方程、相关系数及检出限Table 2 Linear regression equation,correlation coefficient and limit of detection of deoxynivalenol

由表2可知，脱氧血腐镰刀菌烯醇标准曲线回归方程为：y=67.891x+0.033，相关系数R2=0.999 8。将样品标准工作液逐级稀释，以3倍信噪比时的质量浓度为能检测的最低质量浓度，该方法线性范围宽，适合不同浓度样品的分析。当3倍信噪比对应的目标物最低响应浓度为仪器最低检出限，根据稀释倍数计算方法检出限。样品前处理方法采用稀释2倍的形式，根据本方法中样品的取样量和定容体积，测得方法的检出限为2.0 μg/kg。

2.4.2 精密度试验结果

取6份100 ng/mL脱氧血腐镰刀菌烯醇标准品，按上述优化的方法进行处理、测定，平行测定6次，计算结果的平均值及相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），结果见表3。

表3 精密度试验结果Table 3 Results of precision tests

由表3可知，脱氧血腐镰刀菌烯醇标准品的RSD值为2.4%＜5.0%，说明该检测方法精密度良好。

2.4.3 回收率试验

在粮谷类样品中分别加入10 μg/mL的脱氧血腐镰刀菌烯醇标准溶液，使样品中脱氧血腐镰刀菌烯醇添加量分别为1 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL，按照1.3的方法测定其含量，并计算回收率，结果见表4。由表4可知，脱氧血腐镰刀菌烯醇的回收率为87.6%～98.9%，RSD值为2.04%～2.68%，表明方法准确度较高，可以用于检测粮谷类中脱氧血腐镰刀菌烯醇含量的检测。

表4 回收率试验结果Table 4 Results of recovery rate tests

2.5 样品的测定

应用所建立的检测方法分别检测小麦粉、玉米粉、啤酒大等样品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量，结果表明部分样品有污染现象，其中小麦粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量范围在0.41～2.88μg/kg，玉米粉其含量范围在10.63～25.88μg/kg，啤酒大麦其含量范围在10.63～55.23 μg/kg，从检测结果看小麦粉中污染风险较低，3种粮谷类样品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量均符合GB/T 2761—2011《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》[18]中规定的限量。

3 结论

本研究建立了免疫亲和柱结合高效液相色谱法测定粮谷类中脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量的分析检测方法。采用2 mL滤液上样，经氮吹仪在40℃时吹干后，用1 mL乙腈-水（20∶80，V/V）定容，在波长220 nm条件下进行检测，色谱峰分离效果良好。结果表明，脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量在20～500 ng/mL范围内线性关系良好（R2=0.999 8），方法检出限为2 μg/kg。精密度试验结果RSD值为2.4%，回收率为87.6%～98.9%，RSD值为2.04%～2.68%。表明该方法准确可靠，特异性强，灵敏度高，可作为粮谷类样品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇快速定量分析。

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[12]唐吉旺，周丛，林源，等.毛细管柱-气相色谱法测定谷物中脱氧雪腐镰刀菌烯醇和雪腐镰刀菌烯醇含量[J].理化检验：化学分册，2012，48（12）：1441-1443.

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[18]中华人民共和国卫生部.GB 2761—2011食品安全国家标准食品中真菌毒素限量[S].北京：中国标准出版社，2011.

Determination of deoxynivalenol in cereals by HPLC

WANG Lijun,YU Jie,SU Along,JIA Hongfang,ZHU Shuqiang*
(Gansu Institute of Food Inspection,Lanzhou 730030,China)

The deoxynivalenol in cereals samples was extracted by purified water and purified by immunoaffinity column,and the conditions of extraction and purification were optimized.The condition of deoxynivalenol was determined by HPLC.The results showed that filtrate 2 ml was dried at 40℃by termovap sample concentrator,with 1 ml acetonitrile-water(20∶80,V/V)constant volume,and then detected at wavelength of 220 nm. The separation effect of chromatographic peak was good.The deoxynivalenol had a good linear relationship in the range of 20-500 ng/ml(R2=0.999 8). The limit of detection was 2 μg/kg.The relative standard deviation(RSD)of precision tests results was 2.4%.The recovery rate was 87.6%-98.9% and the RSD was 2.04%-2.68%,which indicated the method could be used for the quantitative analysis and detection of deoxynivalenol content in cereals since it had the good precision and accuracy.

deoxynivalenol;cereals;immunoaffinity column;HPLC

O657.7

0254-5071（2017）06-0179-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.06.037

2017-02-21

王丽君（1981-），女，助理工程师，大专，研究方向为食品检测。

*通讯作者：朱书强（1981-），男，工程师，博士，研究方向为食品毒素分析与研究。