100%大麦啤酒酿造过程中老化Strecker醛的研究

朱明光，王敏*

（天津科技大学生物工程学院，天津300457）

100%大麦啤酒酿造过程中老化Strecker醛的研究

朱明光，王敏*

（天津科技大学生物工程学院，天津300457）

分别采用上面发酵工艺与下面发酵工艺进行100%大麦啤酒及100%麦芽啤酒的酿制，并对其麦汁的氨基酸含量、老化Strecker醛、自由基以及新鲜啤酒中老化Strecker醛的含量等进行了对比分析。研究发现，就麦汁而言，100%大麦麦汁中老化Strecker醛的含量都明显低于100%麦芽麦汁；同样的麦汁，上面发酵方式还原Strecker醛的能力明显优于下面发酵方式。就啤酒而言，经酵母还原后，新鲜啤酒中的老化Strecker醛含量较麦汁含量低，且100%大麦啤酒中老化Strecker醛的含量低于100%麦芽啤酒中的含量。100%麦芽麦汁的自由基含量是100%大麦麦汁的近3倍。这都预示着100%大麦啤酒的风味稳定性（新鲜度）明显好于100%麦芽啤酒。

100%大麦酿酒；Strecker醛；自由基；氨基酸

啤酒经过一段时间的贮存后会产生老化味，主要是贮存时形成了挥发性的羰基化合物，Strecker醛是啤酒老化风味的重要成分[1]，啤酒老化Strecker醛包括2-甲基-丙醛、3-甲基-丁醛、2-甲基-丁醛、甲硫基丙醛和苯乙醛。贮存期间产生的Strecker醛仅占啤酒中总Strecker醛的15%，85%的Strecker醛来自麦汁制备[2]，所以优化酿酒工艺是减少啤酒中Strecker醛最有效的方法。许多啤酒老化物的前体来自制麦过程，直接使用大麦替代大麦芽酿酒无需经过制麦工艺，可以减少啤酒中老化物质的含量而且对大麦的品质要求不高，可降低啤酒的生产成本，节能减排[3-4]。

当前对100%大麦酿酒的研究，都还是使用传统的下面发酵工艺[5-6]，还没有使用上面发酵工艺的报导。上面发酵啤酒利用上面啤酒酵母，采用上面发酵工艺酿制，具有接种温度高，发酵温度高，发酵快，风味独特等特点[7]。由于缩短了周期，提高了经济效益，有利于扩大生产。

该实验通过对比研究100%大麦麦汁和100%麦芽麦汁的氨基酸含量，采用固相微萃取-气质联用（solid phase microextraction-gaschromatography-mass spectrometry，SPMEGC-MS）检测麦汁和新鲜啤酒中的老化醛含量，并分析自由基含量，以及不同发酵方式对老化Strecker醛的影响，以期为提高啤酒风味稳定性和优化酿酒工艺提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

进口Schooner品种麦芽、进口Schooner品种大麦：澳大利亚；诺维信OndeaProR酶：诺维信中国生物技术有限公司；氨基酸衍生试剂-AQC：美国Waters公司；标准物质（2-甲基丙醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、3-甲硫基丙醛、苯乙醛和糠醛）、苯基叔丁基硝酮（α-phenyl-t-butyl nitrone，PBN）（光谱纯）：美国Sigma公司；乙醇（色谱纯）：德国Merck公司；超纯水（≥18.2 MΩ）：实验室自制。

上面发酵菌株W303-1A：德国慕尼黑Doemens啤酒学院；下面发酵菌株CGMCC2.412：中国科学院普通微生物保藏中心。

1.2 仪器与设备

Milli-Q plus纯水仪：德国Millipore公司；固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）自动进样器：瑞士CTC公司；65μmPDMS-DVB、65μmDVB/Carboxen/PDMS固相微萃取纤维头：美国Supelco公司；Clarus600气相色谱-质谱联用（gaschromatography-massspectrometer，GC-MS）仪：美国PerkinElmer公司；DB-5MS色谱柱（60m×250μm×0.25μm）：美国Agilent公司；ESR电子自旋共振仪：德国Bruker公司；Waters e2695高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪：美国Waters公司；SKALAR全自动流动分析仪：荷兰SKALAR公司。

1.3 方法

100%麦芽麦汁：定型冷麦汁浓度10°P，试验2个发酵罐，1罐上面发酵，1罐下面发酵。

100%大麦麦汁：定型冷麦汁浓度10°P，试验2个发酵罐，1罐上面发酵，1罐下面发酵。

1.3.1 100%麦芽麦汁的制备

糖化锅43℃下料→43℃、25min→50℃、55min→65℃、65 min→78℃过滤

使用对辊粉碎机粉碎麦芽，麦芽下料温度43℃，下料结束，43℃保温25 min，升温至50℃进行蛋白休止55 min，之后并醪升温至65℃，65℃保温65 min糖化，碘检合格后升温至78℃，进行过滤。

1.3.2 100%大麦麦汁的制备

糖化锅50℃下料→50℃、30min→54℃、45min→64℃、65 min→78℃、25 min→78℃过滤

使用六辊粉碎机粉碎大麦；大麦50℃下料，持续搅拌，调整醪液pH值为5.6～5.8，添加诺维信Ondea ProR酶2 kg/t大麦，下料结束，在50℃条件下保温30 min，之后升温至54℃并保温45 min，接着升温至64℃糖化65 min，然后升温至78℃，保温25 min后过滤。

1.3.3 上面发酵法工艺

麦汁冷却至16℃，添加经扩培的上面发酵酵母W303-1A，接种量为扩培液体积与麦汁体积的比例为1∶10。

发酵工艺：16℃发酵，约2 d降糖至4.0°P左右，封罐。封罐后每天检测双乙酰含量，直降至0.05 mg/L以下，开始降温，降至冷贮温度。冷贮结束，后贮酒过滤。

1.3.4 下面发酵法工艺

麦汁冷却至10℃，添加经扩培的下面酵母CGMCC 2.412，接种量为扩培液体积与麦汁体积的比例为1∶10。

满罐温度10℃，主酵温度10℃，当糖度降至6.0°P时，主酵结束，开始升温至12℃进行双乙酰还原，当糖度降至

4.0 °P时，封罐，当双乙酰含量降至0.05 mg/L以下，开始降温，直接降至冷贮温度。冷贮结束，后贮酒过滤。

1.3.5 麦汁α-氨基酸态氮的检测[8]

使用SKALAR全自动流动分析仪进行检测。

1.3.6 麦汁总氮的测定[9]

麦汁总氮含量的测定参考轻工业标准QB/T1686—2008《啤酒麦芽》。

1.3.7 麦汁氨基酸含量的分析[8]

采用Waters系统的HPLC进行分析。采用Waters开发的柱前衍生AccQ·Tag方法进行测定，在衍生的同时增强氨基酸的极性来增强分离效果。AccQ·Tag方法的基础在于专为氨基酸分析而开发的衍生试剂-AQC（6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基氨基甲酸酯）。

1.3.8 固相微萃取-气相色谱-质谱联用测定老化醛含量[10-12]

采用SPME-GC-MS柱上衍生技术。具体步骤如下：

①待测样品处理：啤酒排气，麦汁过滤。在20 mL顶空瓶中加入2 g NaCl。

②取5 mL样品到20 mL顶空瓶，添加50 μL内标物质对氟苯甲醛（原液稀释105倍），旋紧瓶口。

③将65 μm PDMS-DVB固相微萃取纤维插入装有10 mL、60 mg/L邻-（2,3,4,5,6-五氟苄基）羟胺（O-（2,3,4,5,6-pentafluorobenzyl）hydroxylamine，PFBOA）的顶空瓶中，以顶空方式50℃衍生15 min。

④将萃取纤维再放入待测样品顶空瓶中，以顶空方式50℃萃取待测物质45 min。

⑤上机检测。

GC条件：色谱柱DB-5 ms（60 m×320 μm×0.25 μm）。载气为氦气，流速1 mL/min。进样口温度250℃。无分流进样。程序升温：40℃保温2 min；以10℃/min升至140℃；以7℃/min升至250℃；250℃保温3 min。

MS条件：电子电离（electron ionization，EI）离子源，电子能70 eV；GC-MS接口温度：250℃；离子源温度：230℃；四极杆温度：150℃；扫描范围：50～550 amu。

羰基化合物的PFBOA衍生物的定性采用质谱全扫描方式，标准物质定性、定量选择离子（61、181m/z）扫描方式。

⑥采用外标系列曲线定量。

1.3.9 电子自旋共振仪检测自由基[13-15]

采用德国Bruker公司的电子自旋共振仪（electron spin resonance，ESR）进行测定，测定方法：

（1）ESR操作条件：

中心磁场3458 G；扫描宽度17 G；时间常数5.12；数据采集次数8次；微波功率2.36 MW；微波频率86 kHz；调制幅度2.0 G；放大倍数2.0×103，数据处理方式S拟合。

（2）样品处理：

样品经离心或过滤脱气，吸取9.6 mL入棕色瓶中，加入0.4 mL PBN溶剂，涡旋混匀，放在60℃加热池中机械温浴。仪器会自动捕获到每个时间段的自由基强度，并进行S拟合。

2 结果与分析

2.1 麦汁成分分析

利用HPLC法分别对100%大麦麦汁和100%麦芽麦汁的氨基酸含量进行了分析，并对与氨基酸相关的总氮、α-氨基酸态氮含量进行了测定，相关数据分别见表1、表2。

表1 麦汁的理化指标Table 1 Physiochemical indicators of the wort

表2 麦汁中氨基酸含量分析Table 2 Amino acids contents analysis in different wort

由表1可知，100%大麦麦汁的总氮和α-氨基酸态氮含量都比100%麦芽麦汁的低。从表2氨基酸含量分析中可以看出，100%大麦麦汁中A组快速吸收氨基酸、B组中速吸收氨基酸和C组慢速吸收氨基酸，所占氨基酸总量的比例分别为35%、28%和25%；而100%麦芽麦汁中A组、B组和C组所占氨基酸总量的比例分别为30%、25%和23%。不难看出，100%大麦麦汁与100%麦芽麦汁比较，A组+B组所占比例增加了8%，A组+B组+C组所占比例增加了10%；所以尽管大麦麦汁的α-氨基酸态氮含量约为140 mg/L，较麦芽麦汁中的含量163 mg/L低，但大麦麦汁中可被酵母吸收利用的氨基酸所占的比例较高，因此，能够满足酵母生长、发酵对氨基酸的需求[3]。

麦汁中的氨基酸含量能够满足酵母生长繁殖和发酵过程的需要即可，含量过高则可能会通过Strecker降解，生成相应的Strecker醛。Strecker降解是发生在氨基酸和α-二羰基化合物之间的反应。反应过程是：先发生转胺作用，然后形成的α-酮酸发生脱羧，从而形成比对应氨基酸少一个碳原子的醛类。

由表3可知，5种啤酒老化Strecker醛（2-甲基-丙醛，3-甲基-丁醛，2-甲基-丁醛，甲硫基丙醛，苯乙醛）及与其相对应的5种氨基酸（缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸）在100%大麦麦汁和100%麦芽麦汁中的含量。其中缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和蛋氨酸属于B组中速吸收氨基酸；苯丙氨酸属于C组慢速吸收氨基酸。结果表明，这5种氨基酸在100%大麦麦汁中的含量都低于100%麦芽麦汁中的含量。

表3 Strecker醛及对应的氨基酸的含量Table 3 The contents of strecker aldehyde and corresponding amino acid

2.2 麦汁及新鲜啤酒中老化醛含量的分析

分别对100%大麦麦汁和100%麦芽麦汁中老化醛（5种Strecker醛和糠醛）的含量进行了分析，相关数据分别见表4、表5；对100%大麦麦汁和100%麦芽麦汁分别采用上面发酵方式和下面发酵方式酿制成的啤酒中的老化醛也进行了分析，相关数据见表6。

表4 Strecker醛在不同麦汁中的含量Table 4 Strecker aldehyde contents in different wort

由表4可知，这5种啤酒老化Strecker醛的含量，都是100%麦芽麦汁明显高于100%大麦麦汁，这可能主要是由于100%大麦麦汁中α-氨基酸态氮以及5种啤酒老化Strecker醛所分别对应的5种氨基酸的含量都较100%麦芽麦汁中的低，而且大麦不像麦芽在制麦过程中已经经受了高温热负荷，促进了啤酒老化物质Strecker醛的生成。

表5 糠醛在不同麦汁中的含量Table 5 Furfural contents in different wort

糠醛作为啤酒老化物质之一，是反应热负荷的指示指标之一，是制麦焙焦阶段和麦汁煮沸阶段的美拉德反应产物。由表5可知，糠醛在100%麦芽麦汁中的含量明显高于100%大麦麦汁，前者含量是后者的近2倍。这表明100%大麦麦汁经受的热负荷明显低于100%麦芽麦汁。100%大麦麦汁中的啤酒老化物质之一的糠醛含量也明显比100%麦芽麦汁的低，5种啤酒老化Strecker醛的生成量也明显的低于100%麦芽麦汁，预示着100%大麦啤酒的风味稳定性要优于100%麦芽啤酒。

表6 Strecker醛在不同麦汁酿造的新鲜啤酒中的含量Table 6 Strecker aldehyde contents in differents fresh beer

麦汁中含有的啤酒老化物质Strecker醛类和糠醛只能靠发酵过程中的酵母来还原成醇，还原的程度，主要取决于酵母的活性及酵母的还原能力。由表6可知，经过发酵过程中的酵母还原后，5种老化醛的含量较麦汁中的含量水平下降非常明显。总体来说，同样的麦汁，上面发酵方式还原Strecker醛的能力明显优于下面发酵方式。100%大麦麦汁酿造出的啤酒中老化醛的含量都比100%麦芽麦汁酿造出的啤酒中的含量低，其中在两种发酵方式酿造的大麦啤酒中，均无2-甲基丁醛，可能是由于其在100%大麦麦汁中的含量低于酵母对其完全还原的下限水平。除了跟酵母的还原能力、发酵方式有关外，这与100%大麦麦汁中这5种老化醛本身的含量低也有直接关系。这也预示着100%大麦啤酒的风味稳定性（新鲜度）优于麦芽啤酒。

2.3 自由基含量的分析

电子自旋共振法（ESR）是可以直接定量测定自由基（free radical，FR）的技术方法。啤酒氧化是一系列的生化反应的结果，极其复杂，利用ESR技术对啤酒的抗氧化力进行评估较其他方法更准确。ESR检测自由基结果示意图见图1。

自由基从少量到大量产生的拐点所对应的时间就是迟滞时间（lagtime），其值大小反映出了啤酒的内源抗氧化能力（endogenousantioxidativepotential，EAP），用来预测啤酒的风味稳定性的时间（风味保鲜期），此值越大表示啤酒的风味稳定性越好。T150是150 min时检测到的自由基强度，此值越小，说明自由基含量越少；同样，在相同的时间，所对应的自由基强度的峰面积积分越小，说明自由基含量越少，而样品本身的内源抗氧化能力越高，则啤酒的风味稳定性会更好。利用ESR电子自旋共振仪对100%大麦麦汁和100%麦芽麦汁中自由基也分别进行了检测，数据结果见表7。

图1ESR检测自由基结果示意图Fig.1 Sketch map of free radicals intensity by ESR

表7 麦汁自由基的检测结果Table 7 Determination results of free radicals in wort

由表7可知，T150值看出麦芽麦汁是大麦麦汁的2.94倍；从峰面积来看，麦芽麦汁是大麦麦汁的2.80倍。这说明，麦芽麦汁的自由基含量远高于大麦麦汁，几乎是大麦麦汁自由基含量的3倍，即大麦麦汁的内源性抗氧化能力是麦芽麦汁的近3倍，也预示大麦啤酒的风味稳定性（风味保鲜期）要远远好于麦芽啤酒。与李崎等[15]得到的同重量麦芽的自由基量多于大麦，制麦过程的较高温度促进了自由基生成并积累的结论一致。

3 结论

就麦汁而言，100%大麦麦汁中老化Strecker醛的含量明显低于100%麦芽麦汁；同样的麦汁，上面发酵方式还原Strecker醛的能力明显优于下面发酵方式。就啤酒而言，经酵母还原后，新鲜啤酒中的老化Strecker醛含量较麦汁含量低，且100%大麦啤酒中老化Strecker醛的含量低于100%麦芽啤酒。100%麦芽麦汁的自由基含量是100%大麦麦汁的近3倍。这都预示着100%大麦啤酒的风味稳定性（新鲜度）明显好于100%麦芽啤酒。

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Aging Strecker aldehydes in 100%barley beer brewing

ZHU Mingguang,WANG Min*
(College of Bioengineering,Tianjin University of Science&Technology,Tianjin 300457,China)

100%barley beer and 100%malt beer were brewed with top-fermentation and bottom-fermentation technology,respectively.The content of amino acids,aging Strecker aldehydes,free radicals in wort,as well as aging Strecker aldehydes content in fresh beers were analyzed.Results showed that in terms of wort,the content of aging Strecker aldehydes was much lower in 100%barley wort than in 100%malt wort,and the ability of reducing Strecker aldehydes was obviously better with top-fermentation process than with bottom-fermentation process.It was also found that in terms of beer,the content of aging Strecker aldehydes in beers brewed with 100%barley was lower than those with 100%malt.The free radical level in 100%malt wort was nearly 3 times of that in 100%barley wort.All above results indicated that 100%barley beer has much better flavor stability (freshness)than 100%malt beer.

100%barley brewing;Strecker aldehydes;free radicals;amino acids

TS262.5

0254-5071（2017）06-0028-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.06.006

2017-03-08

国家高技术研究发展计划‘863计划’（2013AA102106）；国家自然科学基金项目（31471722）；教育部“长江学者和创新团队发展计划”项目（IRT15R49）；天津市科技支撑计划（16YFZCNC00650）

朱明光（1971-），男，工程师，博士研究生，研究方向为发酵工程。

*通讯作者：王敏（1971-），女，教授，博士，研究方向为发酵工程。