不同株系赤霞珠葡萄表皮酵母菌的多样性研究

张俊杰，杨旭，焦健，陈锦永，何培新，迟雷，张文叶，刘崇怀*

（1.郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南郑州450002；2.食品生产与安全河南省协同创新中心，河南郑州450002；3.中国农业科学院郑州果树研究所，河南郑州450009）

不同株系赤霞珠葡萄表皮酵母菌的多样性研究

张俊杰1，2，3，杨旭1，焦健3，陈锦永3，何培新1，迟雷1，张文叶1，刘崇怀3*

（1.郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南郑州450002；2.食品生产与安全河南省协同创新中心，河南郑州450002；3.中国农业科学院郑州果树研究所，河南郑州450009）

通过采用富集分离方法，从3个赤霞珠株系（R5、ISV-FV5和169）的葡萄果实表皮共分离得到酵母菌36株。利用26S rDNA的D1/D2和5.8S-ITS区序列分析并结合形态学特征对这些菌株进行了多样性研究。共鉴定出3个酵母菌属的4个已知种群，分别为Cryptococcus magnus、Cryptococcus uzbekistanensis、Rhodosporidiobolus ruineniae和Hanseniaspora uvarum。Hanseniaspora uvarum为株系R5所特有，Cryptococcus uzbekistanensis和Rhodosporidiobolus ruineniae为株系ISV-FV5所特有，而Cryptococcus magnus同时存在于株系ISV-FV5和169上。结果表明，不同株系的赤霞珠葡萄表皮蕴含着多种类型的酵母菌资源，而且尽管其生长的客观条件是一致的，但因为株系的不同其所含酵母菌种群的组成上也存在明显的差异。

赤霞珠；酵母菌；26S rDNA D1/D2；5.8S-ITS；多样性

由于葡萄酒独具的营养滋补作用、医学作用（如延缓衰老、预防心脑血管疾病）、预防癌症、美容养颜作用及文化熏陶的作用，使得近年来葡萄酒在我国国内需求不断增长，我国成为了世界上葡萄酒消费增长最快的市场。到2015年，我国葡萄栽培面积已经达到77.9 khm2，葡萄产量达到1 367万t，葡萄酒年产量114万kL，已经成为世界瞩目的葡萄生产第一大国。中国葡萄酒产区主要集中于北纬38～53°之间的黄金带上，由东向西，梯次布局，如渤海湾产区、沙城产区、清徐产区、黄河故道产区等。从葡萄的品种看，赤霞珠、蛇龙珠、美乐和霞多丽是中国各大产区比较普遍种植的葡萄品种[1-2]。

影响葡萄酒风味的原因主要有3个，即酿酒原料（酿酒葡萄）、酿造工艺以及发酵过程中微生物的代谢，其中以微生物的代谢影响最为重要，菌种的差异决定了风味物质的含量与种类[3]。葡萄酒的发酵过程是一个复杂的微生物参与的生物化学变化过程，酵母菌是发酵过程的主导微生物[4]。在葡萄酒生产中，酵母作为主要的发酵微生物不仅对葡萄酒产量、质量和发酵生产管理影响很大，而且对葡萄酒特色和风格的形成有重要贡献[5]。葡萄酒发酵过程中的大多数酵母来自果皮，仅有少数来自空气。葡萄表面的野生酵母是最丰富的。成熟葡萄裂果流汁，促使酵母繁殖，因此成熟葡萄果粒表面附生大量酵母菌。果皮蜡质有助于这些酵母菌的附着，因此葡萄果粒破碎后不久酵母就会大量繁殖，出现自然发酵现象[6]。葡萄酒中重要的香气物质（如挥发酸、酯类、高级醇等）的组成与含量比例都与酵母菌有密切关系[7-8]。

在传统葡萄和葡萄酒产区，酵母菌适应了当地的气候、土壤、葡萄品种，以及自然选择的作用，逐渐形成了适应当地葡萄酒的菌系。所以，传统葡萄酿酒园区酿出的美酒，与商业化相比，具有很强的产区风格和地方特性[5]。目前我国在葡萄酒酵母的研究和利用方面发展还远不如生产方面的发展迅速，葡萄酒生产所用菌种大部分依赖进口，造成在品种和风格上比较单一，地域特色不突出[9-10]。目前，大部分的研究都是对于一种葡萄的酵母资源所做的研究，对不同株系的同一品种的葡萄酵母资源研究鲜有报道。

国外对酵母资源的研究，早期以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）为主。近年来，葡萄酿酒酵母菌的研究不再局限于酿酒酵母，非酿酒酵母的酿酒特性研究、生物多样性研究及分类鉴定逐渐成为国外近年来的研究热点[11]。我国对酿酒葡萄相关酵母菌多样性的研究报道较少。杨美景[11]从昌黎葡萄产区141个菌源样品中分离到2 101株酵母菌；李新菊[12]从新疆石河子葡萄园的优质葡萄“霞多丽”自然发酵汁中分离出5株酵母菌；张春芝等[13]从宁夏产区的葡萄园土壤、葡萄果实表皮已经葡萄酒发酵过程中获得729株野生酵母菌，最终确定为16个酵母类型；凌云[14]从昌黎产区以赤霞珠葡萄果粒为材料，分离出33株酵母菌，最终获得优异菌株CLY03和CLY04。

河南省境内目前在葡萄属（Vitis viniferaL.）植物发现了14个种、1个亚种及1个变种[15]。本研究以中国农业科学院郑州果树所葡萄资源圃中不同株系的酿酒葡萄“赤霞珠”成熟果实新鲜表皮为原料，对酵母菌进行富集分离和多样性研究（WL表型鉴别和26S rDNA D1/D2区段及5.8S-ITS区测序和系统发育分析[16]），初步比较了不同株系赤霞珠葡萄表皮所蕴含酵母菌种群的组成差异。本研究对赤霞珠葡萄不同株系果皮酵母菌组成的认识，对葡萄酒制作过程中对酿酒葡萄的选择具有一定的指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样品来源

葡萄原料采自郑州果树研究所葡萄种质资源圃，选择赤霞珠葡萄共3个不同的株系（R5、ISV-FV5和169，分别用1、2和3表示）的成熟果实各三串（由于葡萄种质资源圃一株葡萄的数量很少，所以每株只选取了3串）。采集当天运回实验室，于无菌条件下从每个株系的三串葡萄平均取葡萄表皮并混合作为该株系的菌种富集出发材料，直接摇瓶发酵。

1.1.2 培养基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培养基、WL培养基：北京双旋微生物培养基制造厂。

1.1.3 主要试剂

Ezup柱式基因组DNA抽提试剂盒（酵母）、26SrDNA引物：NL-1（5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'）、NL-4（5'-GGT CCG TGT TTCAAG ACG G-3'）：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-2D超净工作台：苏州净化安泰公司；LRH-250生化培养箱：中兴科技有限公司；HH-S恒温水浴锅：江苏省金坛市医疗器械有限公司；TCL-16G台式离心机：上海安亭科学仪器厂；C1000聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增仪：美国伯乐公司；JY04S-3C凝胶成像系统：上海精密科学仪器有限公司；FD-4new真空干燥机：郑州沃邦仪器设备有限公司；DH-600型电热恒温振荡培养箱：北京科伟永兴仪器有限公司；BL3-DYY-6C电泳仪：西化仪（北京）科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄皮酵母菌富集、分离及纯化

在灭过菌的50 mL YEPD液体培养基的三角瓶中无菌条件下加入10颗葡萄浆果表皮，同时加入200 μL氯霉素（10 mg/mL）溶液（抑制细菌生长），每个株系做3组。在摇床中180 r/min，28℃条件下培养48 h。

用1 000 μL移液器吸取酵母富集液1 mL，加入9 mL无菌水试管中，旋涡振荡混匀，制成10-1酵母菌悬液，标上记号。按照上述方法依次稀释，制成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8酵母菌稀释液。

用200 μL移液器取200 μL上述梯度稀释的酵母菌悬液滴加在YEPD固体培养基平板（加入氯霉素）上，用涂布棒涂布均匀，每个梯度平行涂布两个平板。涂布好的平板放置在恒温培养箱中28℃条件下培养3 d。结合挑取YEPD培养基上不同形态的选取10～20个菌落保藏，在新的YEPD平板上3次划线纯化，并倒置培养在恒温培养箱中28℃条件下培养3 d。

1.3.2 WL培养基表型鉴定及代表菌株的显微形态观察

挑取YEPD平板上的酵母菌单菌落，在WL培养基上3次划线并倒置于恒温培养箱中28℃条件下培养5 d。然后，根据菌落表型的差异，对供试菌进行初步分类并挑选代表菌株进行显微形态的观察。显微形态观察在光学显微镜下进行，采集代表菌株的显微形态照片，并做好记录。

1.3.3 菌株的保存及菌体的收集

挑取酵母菌单菌落接种于含有3 mL YEPD液体培养基的试管中，在恒温摇床上以180r/min的转速，28℃的培养温度，振荡培养24 h。超净工作台内取1 mL菌液与1 mL无菌的50%甘油混匀并加入甘油管中，于-80℃冰箱冷冻保存。另取1.5 mL菌液于1.5 mL离心管中，12 000 r/min离心1 min，收集菌体，暂存于-20℃冰箱中。

1.3.4 酵母菌的分子生物学鉴定

（1）代表菌株DNA的提取

按照Ezup柱式基因组DNA抽提试剂盒的说明提取酵母菌基因组DNA，并在1%的琼脂糖凝胶上电泳检测提取DNA的质量。

（2）26S rDNA Dl/D2区段的扩增及测序

使用正向引物NL1（5′-GCATATCGGTAAGCGGAG GAAAAG-3′），反向引物NL4（5′-GGTCCGTGTTTCAAG ACGG-3′）进行26SrDNADl/D2区段的聚合酶链反应（PCR）扩增。PCR扩增条件为：95℃预变性5 min，然后94℃变性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸1 min 20 s，循环次数35次，最后，72℃延伸8 min。PCR反应液组成（30 μL体系）：每管中PCR缓冲液（10×）3.0 μL；25 mmol/L MgCl21.8 μL；2.5 mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside，dNTP）2.4 μL；10 μmol/L引物各0.6 μL；5 U/μLTaqDNA聚合酶0.6μL，模板DNA 1μL；最后添加ddH2O定容至30μL。

（3）5.8S-ITS区段扩增[17]

使用正向引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和反向引物ITS4（5′-TCCTCCG CTTATTGATATGC-3′）进行5.8S-ITS区基因扩增。PCR循环次序为：95℃预变性5min，95℃变性1min，52℃退火2min，72℃延伸2min，循环次数35次，最后，72℃延伸10 min。PCR反应液的组成（50 μL体系）：每管中含PCR缓冲液（10×）5.0μL；25mmol/L MgCl26.0 μL；10 mmol/L dNTP 1.0 μL；10 μmol/L引物各2.5 μL；0.5 U/μLTaqDNA聚合酶4 μL，l0 ng/μL～l μg/μL模板DNA 1.0 μL；最后添加ddH2O定容至50 μL。

（4）PCR反应产物的电泳检测：

取2 μL PCR产物与1 μL 10×上样缓冲液混合，点样到1%的琼脂糖凝胶（已加入Goldview I型核酸染液）点样孔里，打开电源开关，电压调至100 V，电泳时间约20 min，用紫外分析仪观察电泳结果，初步判断扩增片段的质量和大小，扩增合格的PCR产物送往公司测序。

（5）PCR产物测序及系统发育分析

测序结果采用MegA6软件进行序列校正，校正后的26S rDNA D1/D2区序列及5.8S-ITS区段序列在美国国家生物技术信息中心（national center of biotechnology infor mation，NCBI）数据库中进行同源序列比对（BLAST）。获得同源酵母菌株的相应序列后，用MEGA6软件的ClustalW功能对所有供试序列进行匹配排列，然后采用Kimura 2-parameter模型构建邻接法（neighbor-joining，N-J）系统发育树，该分析进行1 000次的Bootstraps检验。

2 结果与分析

2.1 酵母菌的形态学观察及初步聚类分析

2.1.1 葡萄表皮酵母菌的分离、纯化与保藏

通过YEPD液体培养基的富集及固体培养基平板的分离和纯化，一共从供试3个株系的葡萄表皮分离纯化和保藏酵母菌菌株36个。

2.1.2 酵母菌的菌落形态、显微观察及初步聚类分析

根据36株酵母菌菌株在WL培养基上的表型特征，一共得到6种表型，然后，通过对每个表型代表菌株的显微形态观察，共得到3种显微形态，结果见图1。详细的菌株菌落形态及显微形态描述见表1。

图1 各类型代表菌株在WL培养基上的菌落特征(左)和显微细胞特征(右)Fig.1 Colony characteristics(left)and microscopic cell characteristics(right)of the representative strains from different types on WL medium

表1 酵母菌基于WL培养基的表型聚类结果Table 1 Clustering analysis of yeast strains on WL medium based on phenotypes

2.2 酵母菌代表菌株26S rDNA D1/D2区段的PCR鉴定

2.2.1 酵母菌代表菌株26S rDNA D1/D2区段的PCR扩增分析

分别从以上6类菌株中挑选代表菌株（101、104、111、115-2、119、203、205、207、209、303、308）进行DNA的提取和26S rDNA D1/D2区段的PCR扩增，扩增产物的凝胶检测结果见图2，目的区段大小约600 bp。

图226S rDNA D1/D2区段PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果Fig.2 Agarose gel electrophoresis results of 26S rDNA D1/D2 region of PCR products

2.2.2 26S rDNAD1/D2区段PCR扩增产物的测序与分析

得到的PCR产物送测序公司进行序列测定，得到的序列结果首先在NCBI主页（www.NCBI.nlm.nih.gov），利用BLAST功能与Genbank数据库里的已知序列进行同源比对。选择同源性最高的菌株，一般为99%～100%，然后，选用Mega 6软件进行序列的系统发育分析，建立N-J系统发育树，结果见图3。

图3 代表菌株26S rDNA D1/D2区段的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of 26S rDNA D1/D2 for the representative strains

由图3可知，菌株202与Rhodosporidiobolus ruineniae聚为一个分支，序列相似性为100%，所以菌株202可以被鉴定为Rhodosporidiobolus ruineniae。菌株203和205与Cryptococcus uzbekistanensis聚为一个分支，序列相似性为100%，因而菌株203和205可以被鉴定为Cryptococcus uzbekistanensis。代表菌株101、104、111、115-2和119与Hanseniaspora uvarum聚在一起，序列相似性为100%，因而被鉴定为Hanseniasporauvarum。而代表菌株207、209、303和308与3个已知酵母菌种群Cryptococcusmagnus、Filobasidium floriforme和Filobasidiumelegans聚为一个分支，且相似性均为100%，这与刘爱国等[17]的研究结果一致，C.magnus、F.magnus和F.floriforme具有完全相同的Dl/D2区域序列，仅依靠26S rDNA D1/D2区序列分析不能区分这几个种。因此，对于26S rDNA序列分析不能确认的菌株207、209、303和308，进行5.8S-ITS区扩增，经BLAST分析及5.8S-ITS区序列相似性计算，与菌株207、209、303、308的5.8S-ITS区序列相似性最大的酵母菌种群为Cryptococcus magnus，且相似性为100%，结果见表2，这几个代表菌株最终被归为Cryptococcusmagnus，也体现了5.8S-ITS区段在酵母菌种群鉴定中的作用。

表2 供试菌株5.8S-ITS序列与相关菌株的序列相似性Table 2 5.8S-ITS of the sequenced strain and the identity withrelated yeast strain

3 结论

本研究选取郑州果树研究所的3个不同株系的赤霞珠葡萄，通过富集和分离共得到36个菌株，最终供试菌被鉴定为3个已知酵母菌属的四个不同的种群Cryptococcus magnus、Cryptococcus uzbekistanensis、Hanseniaspora uvarum和Rhodosporidiobolusruineniae。Hanseniaspora uvarum为株系R5所特有，Cryptococcus uzbekistanensis和Rhodosporidiobolus ruineniae为株系ISV-FV5所特有，而Cryptococcus magnus同时存在于株系ISV-FV5和169上，其中，酵母种群Rhodosporidiobolus ruineniae在过去的研究中鲜有报道。由此可见，株系ISV-FV5表皮酵母菌具有相对丰富的多样性，而株系R5和169的表皮酵母菌组成较为单一。前期研究中还发现来自同一采样点同一采样时间获得的四个不同株系梅鹿辄葡萄表皮含有6种酵母菌，其中Filobasidium floriforme是四个品种所共有的酵母菌种群，而Sporidiobolusruineniae和Hanseniaspora vineae仅为一个株系所独有，而Rhodotorulagraminis则为两个株系所共有，由于四个株系都来自同一个品种且种植的客观环境一致，它们果皮都含有酵母菌种群Filobasidium floriforme，但是由于株系本身的不同，又分别含有不同于其他株系的特殊的酵母菌种群[18]。而本研究中，仅在株系ISV-FV5和169上发现了共同含有的酵母菌种群Cryptococcus magnus，但是三个株系并没有共同的酵母菌种群，并且该研究从赤霞珠葡萄表皮分离得到的酵母菌种群与之前研究中从梅鹿辄葡萄表皮分离得到的酵母菌种群组成也完全不同，这也反映了葡萄品种差异所带来的果皮酵母菌组成的巨大差异。

本研究中还发现属于同一个种群的菌株其形态特征也具有显著的差异，如类型Ⅰ、类型Ⅱ和类型Ⅲ，虽然形态特征不一样，但是经过分子生物学方法发现都属于Hanseniaspora uvarum。酵母菌种类和表型分析结果不完全一致，这与前期的研究结果相一致[19]，所以仅仅依靠传统的鉴定方法是远远不够的。只有把传统的鉴定方法与现代分子生物学鉴定方法相结合，才可以更加有效而准确的对未知酵母菌菌株进行分类鉴定。

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Biodiversity of yeast strains on grape surface from different Cabernet Sauvignon clones

ZHANG Junjie1,2,3,YANG Xu1,JIAO Jian3,CHEN Jinyong3,HE Peixin1,CHI Lei1,ZHANG Wenye1,LIU Chonghuai3*
(1.College of Food and Bioengineering,Zhengzhou University of Light Industry,Zhengzhou 450002,China; 2.Collaborative Innovation Center for Food Production and Safety of Henan Province,Zhengzhou 450002,China; 3.Zhengzhou Fruit Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450009,China)

With enrichment and isolation methods,36 yeast strains were obtained from grape surface of three different Cabernet Sauvignon(R5, ISV-FV5 and 169).The biodiversity of the yeast strains were studied by 26S rDNA D1/D2 domain,5.8S-ITS region sequence analysis and morphological analysis.4 species from 3 genera were recognized,includingCryptococcus magnus,Cryptococcus uzbekistanensis,Rhodosporidiobolus ruineniae and Hanseniaspora uvarum.In addition,H.uvarumwas only found from the clone R5,bothC.uzbekistanensisandR.ruineniaewere only isolated from clone ISV-FV5,whileC.magnuswas found from both clones ISV-FV5 and 169.The results showed that different Cabernet Sauvignon clones consisted diverse yeast species from the grape surfaces.However,though the three clones from the same grape variety were growing under similar objective conditions,the compositions of yeast species on grape surfaces from different clones were obviously different.

Cabernet Sauvignon;yeast;26S rDNA D1/D2;5.8S-ITS;diversity

TS261.1

0254-5071（2017）06-0126-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.06.026

2017-04-07

国家现代农业产业技术体系建设专项资金项目（CARS-30-yz-1）；河南省自然科学基金项目（162300410330）；郑州轻工业学院博士科研基金项目（2014bsjj006）；郑州轻工业学院研究生科技创新基金项目（2016）；河南省科技攻关计划项目（142102110061）

张俊杰（1984-），讲师，博士，研究方向为微生物分类与分子生态学。

*通讯作者：刘崇怀（1965-），男，研究员，博士，研究方向为葡萄遗传育种。