老年糖尿病患者白色念珠菌感染临床分离株的基因分型

赵雪松 吕 岩 张 斌

(齐齐哈尔医学院附属第二医院，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

老年糖尿病患者白色念珠菌感染临床分离株的基因分型

赵雪松 吕 岩 张 斌

(齐齐哈尔医学院附属第二医院，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

目的 探讨老年糖尿病患者白色念珠菌感染临床分离株的基因分型方法。方法 老年糖尿病患者发生念珠菌感染的临床标本185例，采用API20CAUX 酵母菌鉴定系统鉴定，提取DNA后采用PCR方法扩增白色念珠菌25S rDNA基因内含子区和特征性重复序列(RPS)对白色念珠菌进行基因分型。结果 采用25S rDNA引物扩增后的产物分别为450 bp、840 bp及450和840 bp，分别代表基因型A、B、C；185例样本菌株中，51.9%为A型，29.2%为B型，18.9%为C型；采用根据ALT重复序列RPS设计引物扩增后的产物可将基因型A、B、C分为10个亚组，A型中24例为A2，50例为A3，12例为A2/3，8例为A3/4。54例B型中，15例为B2，7例为B3，25例为B2/3，7例为B3/4。35例C型中25例为C2，10例为C2/3。结论 利用25S rDNA和ALT重复序列RPS设计引物扩增产物对老年糖尿病患者样本中白色念珠菌进行基因分型方法具有快速、简捷、可靠、重复性好等优点，可提高治疗效果，减少抗生素滥用和耐药性的产生。

糖尿病；白色念珠菌；分离株；基因分型

目前我国老年糖尿病患者合并真菌感染发病率不断升高，且以白色念珠菌感染为主〔1〕。通常老年患者病情相当复杂、严重，死亡率较高〔2〕。由于老年患者特殊性，可选择抗真菌药物较少〔3〕。本研究通过对我院近2年来内分泌科老年糖尿病患者感染白色念珠菌临床分离株进行基因分型研究，确定其分型，分析菌株遗传相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2013年1月至2015年1月齐齐哈尔医学院附属第二医院内分泌科收治的老年糖尿病患者发生念珠菌感染的临床标本185例(包含取自经临床确诊为糖尿病真菌感染老年患者的痰、大小便、咽拭子、呕吐物等标本分离出的白色念珠菌)，男90例，女95例，年龄65～98〔平均(76.2±3.4)〕岁。

1.2 方法

1.2.1 菌株鉴定 对标本进行病原学检查，经实验室鉴定和药敏分析后的临床分离株进行PCR技术检测分型。采用法国科玛嘉(ChromG A)显色培养基初筛，珠海黑马Bact-IST药敏分析仪进行鉴定和药敏分析，使用梅里埃生物公司API20CAUX 酵母菌鉴定系统鉴定白色念珠菌。

1.2.2 白色念珠菌DNA提取 挑取鉴定培养基上的绿色菌落，分离单菌落后加入酵母漫出粉胨葡萄糖(YPD)液体培养基，于37℃培养过夜，隔天将1 ml培养物离心后用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，采用玻璃珠-苯酚-氯仿法提取白色念珠菌基因组DNA。

1.2.3 PCR引物 临床常对老年糖尿病患者分离样本采用CALB1、CALB2引物扩增菌体DNA，产物273 bp代表含有白色念珠菌。采用PCR方法扩增白色念珠菌25S rDNA基因内含子区，以内含子大小及其中可转座Ⅰ型内含子片段的缺失或插入作为分型依据，可将白色念珠菌分为5种亚型(A/B/C/D/E)，CA-INT-R引物序列：5′-ATAAGGGAAGTCGGCAAAATAGATCCGTAACCTTGGCTGTGGTTTCGCTAGATAGTAGAT-3′，扩增长度450 bp、840 bp、450 bp & 840 bp、1 040 bp、1 050 bp；依次对应A、B、C、D、E型。同时有文献〔4〕报道采用染色体的172 bp长的特征性重复序列(RPS)对白色念珠菌进行种内基因分型，可根据电泳结果分离6种亚型。ASDcF：5′-TGATGAACCACATGTGCTACAAAG-3′，Pcscr：5′-CGCCTCTATTGGTCGAGCAGTAGTC-3′；扩增长度526、698、870、1 042、1 214、1 396 bp，依次对应1～6型。

1.2.4 PCR程序 PCR反应总体积30 μl，含TaqDNA聚合酶0.2 μl(1 U,Selleck,B21101a)，dNTP 1.5 μl(thermos,10 mmol/L each)，引物P1、P2(生工，2 OD)各1 μl。扩增程序：预变性94℃ 3 min；94℃ 1 min，60℃ 40 s，72℃ 1 min，共30个循环；72℃延伸10 min。PCR采用Thermal cycler(Techne，TC512，England)扩增。将扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳100 V/cm在20℃ 20 min后检测。

2 结 果

本研究中收集的临床老年糖尿病患者样本中均检测出白色念珠菌的存在。见图1。所有收集的临床样本分别采用两对引物(Gen Bankaccession nos.L47111，L28817)进行PCR扩增，并进行琼脂糖凝胶电泳检测分析。其中采用25S rDNA引物扩增后的产物分别为450 bp、840 bp及450 bp和840 bp，分别代表基因型A、B、C。老年糖尿病患者白色念珠菌采用25S rDNA引物扩增基因型，在185例样本菌株中，96例(51.8%)为A型，54例(29.2%)为B型，35例(19.0%)为C型，而基因型D和E并未在此次收集的临床样本中检测到。见图2。采用根据ALT重复序列RPS设计引物扩增后的产物可将基因型A、B、C分为10个亚组。老年糖尿病患者白色念珠菌采用RPS引物扩增基因型，96例A型中24例为A2，50例为A3，12例为A2/3，8例为A3/4。54例B型中，15例为B2，7例为B3，25例为B2/3，7例为B3/4。35例C型中25例为C2，10例为C2/3。见图3。

1∶100 bp分子量标准(天根，MD109)；2：白色念珠菌阳性对照(ATCC 10231)；3～10：老年糖尿病患者分离样本根据CALB1、CALB2扩增产物273 bp；11～14：阴性对照光滑念珠菌、热带念珠菌、克鲁斯假丝酵母、类星形念珠菌；15:1 kb分子量标准(天根，MD111)图1 临床样本中菌体检测结果

1～6:450 bp，A型；7～11：840 bp，B型；13～15：450+840 bp，C型图2 老年糖尿病患者样本中白色念珠菌25S rDNA引物PCR扩增产物

1～3：B2亚型，698 bp；4～6：B3亚型，870 bp；7～9：2/3亚型，698 bp+870 bp；10～11：3/4亚型，870 bp+1-42 bp图3 老年糖尿病患者样本白色念珠菌RPS引物PCR扩增产物基因亚型分型结果

3 讨 论

随着白色念珠菌临床病例不断增加，分子分型技术已成为研究念珠菌病流行病学及合理选择药物的基础。分子生物学方法已应用于深部真菌病的诊断和分型研究，形成了以PCR 技术为基础的一系列分子诊断方法，成为感染菌种(型)的早期鉴定和指导前期治疗的有力工具〔5〕。近年来，国内外有关白假丝酵母菌分型的报道很多〔6〕，主要有传统的表型分型方法和基因分型方法。表型分型存在鉴别力弱、重复性差、实验结果变异大、易受环境及人为因素影响、耗时费力等缺点;基因分型是以生物体DNA 序列的差异为基础建立的显示基因组多态性的方法〔7〕。基于核酸的分子生物学方法(主要是PCR方法)是念珠菌诊断、分型的发展趋势，PCR基因分型方法具有快速、简捷、可靠、重复性好等优点。实验从模板DNA提取到PCR扩增后电泳观察结果，共耗时6 h左右，可在1个工作日内完成，比较适合临床念珠菌种内和种间分型研究。本课题首次将白色念珠菌基因分型应用于糖尿病老年患者中，为治疗和预防糖尿病老年患者的真菌感染提供依据。

糖尿病是一种常见的内分泌―代谢疾病，发病率呈逐年上升趋势，尤其在老年患者中尤为突出〔8〕。同时，随着近年来抗生素及免疫抑制剂的普遍应用和滥用，使真菌感染的发病率有明显增加趋势〔9〕，尤其是免疫功能低下的糖尿病患者更为真菌感染提供了充足的条件〔10〕，从浅部到深部的真菌感染率都明显高于非糖尿病病人，且以白色念珠菌感染最为常见〔11〕。本课题采用PCR分型方法，对取自老年糖尿病患者感染白色念珠菌临床分离株进行基因分型，确定其分型。

本研究结果表明，老年糖尿病患者的白色念珠菌基因型分布尚无明显的规律和风险因素，最近有研究结果发现〔12〕,同一老年患者身体不同部位分离出不同基因型白色念珠菌，但目前尚无研究明确表明同一部位感染是单一基因型或多个基因型菌株混合感染导致。对引起老年糖尿病患者感染白色念珠菌进行基因分型研究，初步阐明造成老年糖尿病患者感染白色念珠菌是多基因型株系的,但仍需继续对上述样本的基因型与白色念珠菌菌株分布及耐药性进行系统的相关性统计学分析。

本研究结果提示利用25S rDNA和ALT重复序列RPS设计引物扩增产物对老年糖尿病患者样本中白色念珠菌进行基因分型方法具有快速、简捷、可靠、重复性好等优点，可提高治疗效果，减少抗生素滥用和耐药性的产生。

1 McCullough MJ，Clemons KV,Stevens DA.Molecular and phenotypic characterization of genotypic Candida albicans subgroups and comparison with Candida dubliniensis and Candida stellatoidea〔J〕.J Clin Microbiol,1999;37(2):417-21.

2 厉荣玉，欧成举，陈裕秀.老年病区220株白色念珠菌分离及耐药性分析〔J〕.中国老年学杂志，2014;34(24):7092-3.

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4 马晓瑞，苏加峰，梁明辉.住院老年患者念珠菌感染的动态监测及耐药性分析〔J〕.中国老年学杂志，2014;34(15):4332-3.

5 Luo G，Mitchell TG.Rapid identification of pathogenic fungi directly from cultures by using multiplex PCR〔J〕.J Clin Microbiol,2002;40(8):2860-5.

6 王光锁，吴劲松，杨 林，等.胸外科围术期并发感染的病原菌分布特征及耐药性分析〔J〕.中国老年学杂志，2014;34(16):4528-30.

7 Iwata T，Hattori H，Chibana H，etal.Genotyping of Candida albicans on the basis of polymorphisms of ALT repeats in the repetitive sequence(RPS)〔J〕.J Dermatol Sci,2006;41:43-54.

8 吴奎海，芮勇宇.老年患者痰液中病原菌种类及耐药性变迁分析〔J〕.中国老年学杂志，2011;31(22):4316-8.

9 Hattori H，Iwata T，Nakagawa Y，etal.Genotype analysis of Candida albicans isolates obtained from different body location of patients with superficial candidiasis using PCRs targeting 25S rDNA and ALT repeat sequences of the RPS〔J〕.J Dermatol Sci,2006;42(1):31-46.

10 李艳华，冯福民，郭 梅.恶性肿瘤老年患者念珠菌感染临床分离株的基因型特征研究〔J〕.中国老年学杂志，2007;27(18):1772-4.

11 Gurbuz M，Kaleli I.Molecular analysis of Candida albicans isolates from clinical specimens〔J〕.Mycopathologia,2010;169(4):261-7.

12 朱洪权，刘佰纯，王志慧，等.老年患者158株念珠菌分离及耐药性分析〔J〕.中国老年学杂志，2005;25(10):1179-80.

〔2017-01-12修回〕

(编辑 袁左鸣)

齐齐哈尔科学技术局指令性计划项目(No.SFGG-201320)

赵雪松(1973-)，男，副主任医师，主要从事微生物检验、细菌和真菌耐药监测研究。

R587.1

A

1005-9202(2017)13-3167-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.020