阿米替林对肠易激综合征大鼠结肠和下丘脑促肾上腺皮质激素释放因子表达的影响

赵廷坤 刘兆霞 曲梅花

(潍坊医学院应用药理学山东省重点实验室 潍坊医学院药理学教研室，山东 潍坊 261053)

阿米替林对肠易激综合征大鼠结肠和下丘脑促肾上腺皮质激素释放因子表达的影响

赵廷坤 刘兆霞 曲梅花

(潍坊医学院应用药理学山东省重点实验室 潍坊医学院药理学教研室，山东 潍坊 261053)

目的 探讨阿米替林对肠易激综合征(IBS)大鼠结肠和下丘脑促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)表达的影响。方法 将30只成年Wistar大鼠随机分为3 组：正常对照组、 IBS模型组、阿米替林组。采用体重、排便粒数、敞箱实验评分和糖水偏嗜度，评价阿米替林对IBS的作用，采用RT-PCR和Western印迹检测大鼠结肠和下丘脑中CRF表达水平的变化。结果 IBS模型大鼠体重下降、排便增加、运动减少和兴趣缺失，同时下丘脑和结肠CRF的表达均显著高于正常对照组(P<0.05)，阿米替林预防应用可改善IBS模型大鼠的症状，同时可减少IBS模型大鼠下丘脑和结肠CRF的表达(P<0.05)。结论 预防应用阿米替林可改善IBS大鼠的症状，其机制可能与结肠和下丘脑CRF的表达下降有关。

阿米替林；促肾上腺皮质激素释放因子；肠易激综合征

肠易激综合征(IBS)发病机制尚未完全明确。研究认为精神心理因素在IBS的发病中起重要作用，应激、焦虑和抑郁与IBS密切相关，抗抑郁药可改善患者的肠道及精神心理症状〔1〕。促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)是一种重要的神经内分泌肽，精神心理因素能够改变CRF家族参与的信号通路，促使功能性肠道疾病的发生〔2〕，大脑和肠道中的CRF家族因子是急性或慢性刺激中的重要调节因子。阿米替林是临床最常用的三环类抗抑郁药，可改善IBS患者精神神经功能〔3〕，本研究以急慢性联合应激制作IBS模型大鼠，并用阿米替林进行干预，通过RT-PCR和Western印迹检测CRF在下丘脑和结肠的表达，探讨其表达变化与IBS发病的关系，为抗抑郁药阿米替林治疗IBS的作用机制提供新证据。

1 资料与方法

1.1 实验试剂和仪器 荧光定量RT-PCR试剂盒，总RNA提取试剂盒，cDNA逆转录合成试剂盒，DEPC，EDTA均由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。兔抗大鼠CRF多克隆抗体、兔抗大鼠β-actin多克隆抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG、化学发光试剂盒均由北京博奥森生物技术有限公司提供。美国PE公司5700型定量基因分析仪，美国ProteinSimple公司AlphaImager EP数字成像分析系统。

1.2 实验动物和分组 雄性Wistar大鼠，4～6周龄，SPF级，体重180～200 g，由山东鲁抗医药股份有限公司实验动物室提供，许可证号：SCXK鲁2008 0002。实验动物30只随机分为 3 组：对照组、模型组、阿米替林组，模型组采用急慢性联合应激制备模型，参照文献〔4〕施加以慢性不可预见性的刺激21 d，第28天给予急性束缚应激〔5〕；正常对照组大鼠单笼常规饲养，不给予任何刺激，模型组和阿米替林组大鼠单只孤养，阿米替林组从施加刺激起每天给予腹腔注射10 mg/kg阿米替林(剂量参考文献〔6〕)。

1.3 肠道敏感性评估 ①体重测定：在造模前和造模后分别测定大鼠体重。②排便测定：测定造模前和造模后各组大鼠在2 h内的排便颗粒数。③敞箱实验〔7〕：所用敞箱高40 cm，长宽均为80 cm，各壁均为黑色，用白线划分底面为面积相等的25 块。实验在明暗合适、安静的房间中进行。将单只大鼠置于敞箱中央，测定其5 min内穿越地面方块数作为水平运动得分，以站立次数为垂直运动得分。水平穿越1 格为1分，垂直站立1次为1分，两者相加为敞箱实验评分。④糖水消耗实验〔4〕：将试验分为训练期和测试期。实验前72 h，训练各组大鼠适应含糖饮水，先给予大鼠两瓶重量一致 1%蔗糖水24 h，然后给予1瓶1%蔗糖水和1瓶纯水饮用24 h，两瓶重量一致。适应完成后，禁水禁食 24 h，在安静通风、明暗合适的环境中进行测试：同时给予每只大鼠1瓶200 ml 1%蔗糖水和1瓶200 ml纯水，24 h后测量各自的消耗量，按下式计算：蔗糖水偏嗜度=糖水消耗量/(糖水消耗量+纯水消耗量)×100%。比较造模前后蔗糖水偏嗜度的变化。

1.4 定量RT-PCR检测CRF基因表达 对大鼠予水合氯醛腹腔注射麻醉、断头处死，取大脑组织，在冰上剥离出下丘脑，组织称重后，置于液氮保存；剖腹手术分离远端结肠，取距肛门约4 cm处结肠1 cm，置于液氮内，再转至-80℃冰箱保存。按照试剂盒说明提取下丘脑和结肠总RNA，并逆转录出cDNA。从Gene Bank中查出大鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、CRF mRNA 序列，设计引物如下：GAPDH 上游引物：5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′；下游引物：5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA3′；扩增产物143 bp；CRF上游引物：5′-TGGATCTCACCTTCCACCTTCTG-3′，下游引物：5′-CCGATAATCTCCATCAGTTTCCTG-3′；扩增产物101 bp。取2 μl cDNA为模板进行PCR扩增，加入扩增反应体系中，设三个复孔，PCR反应体系(25 μl)如下：12.5 μl MIX，6.5 μl ddH2O，上下游 引物各2 μl，2 μl cDNA模板。GAPDH和CRF反应条件：50 ℃ 2 min，预变性95 ℃ 5 min，变性94 ℃ 5 s，退火：GAPDH，59 ℃，CRF，57℃，30 s，延伸72 ℃ 30 s，共40个循环，终末延伸72 ℃ 7 min。PCR产物用2 %琼脂糖凝胶电泳，应用凝胶成像分析系统扫描分析，通过Quantity One软件分析光密度值。CRF的条带密度与内参GAPDH条带密度的比值，作为CRF基因mRNA表达的相对水平。

1.5 Western印迹检测CRF蛋白表达 将下丘脑和结肠，分别加入细胞蛋白裂解液提取蛋白，Bradford方法测定蛋白浓度，配置8%的SDS-PAGE凝胶，将总蛋白加样，恒压电泳，恒流转膜，加入5%的脱脂奶粉封闭过夜，加一抗兔抗大鼠CRF多克隆抗体，孵育2 h，PBS洗涤2次，加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，孵育2 h，ECL显色，暗室曝光，凝胶图像用Quantity One软件分析。

1.6 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件进行F及t检验。

2 结 果

2.1 肠道敏感性评估 造模前各组大鼠体重、粪粒数、敞箱实验评分和蔗糖偏嗜度无差异，给予急慢联合应激刺激后，模型组大鼠体重和敞箱实验评分均显著低于对照组(P<0.05)，模型组大鼠排便数量明显多于对照组(P<0.05)，同时模型组大鼠兴趣缺失，糖水偏嗜度降低(P<0.05)；给予阿米替林干预，可增加大鼠体重和敞箱实验评分，均高于模型组(P<0.05)，使大鼠排便数减少，改善模型组大鼠兴趣缺失，提高糖水偏嗜度(P<0.05)，见表1。

表1 各组肠道敏感性比较

与对照组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05

图1 下丘脑和结肠组织中CRF和GAPDH的RT-PCR结果

2.2 结肠和下丘脑CRF mRNA的检测 CRF和GAPDH的扩增曲线成单峰，表明扩增的PCR产物单一，无特异性扩增产物。如图1显示CRF和GAPDH片段扩增情况，CRF片段为101 bp，GAPDH片段为143 bp，CRF和GAPDH扩增片段退火曲线结果显示PCR产物为预期设计的特异片段。CRF mRNA表达以GAPDH为内参对照，RT-PCR结果显示，与对照组(结肠：0.39±0.04，下丘脑：0.34±0.02)比较，模型组大鼠结肠(1.07±0.12)和下丘脑(1.32±0.11)中CRF的表达量均有升高(P<0.01)；阿米替林组大鼠结肠(0.74±0.07)和下丘脑(0.70±0.05)中CRF的表达量均低于IBS模型组大鼠(P<0.05)，但其高于对照组大鼠(P<0.05)。见图2。

图2 各组结肠和下丘脑组织中CRF mRNA的表达

2.3 结肠和下丘脑CRF蛋白的表达 CRF蛋白表达变化以β-actin为内参对照，Western印迹结果显示，与对照组(结肠：0.40±0.02；下丘脑：0.49±0.03)比较，模型组大鼠结肠(1.21±0.13)和下丘脑(1.12±0.11)中CRF蛋白的表达量均有升高(P<0.01)；阿米替林组大鼠结肠(0.59±0.04)和下丘脑(0.81±0.08)中CRF蛋白的表达量均低于模型组大鼠(P<0.05)，但其高于对照组大鼠(P<0.05)。见图3。

图3 各组结肠和下丘脑组织中CRF 蛋白表达

3 讨 论

IBS病因复杂，是生理-心理-社会综合病征的代表之一，其发病机制可能与胃肠功能异常、内脏感觉高敏感性以及脑-肠轴异常等因素相关〔5〕。应激能够引起IBS内脏高敏性的形成，引起或者加重IBS症状。本课题组前期给予Wistar大鼠急慢性联合应激，可成功建立IBS大鼠模型〔8〕，本研究采用此方法建立IBS模型。

CRF主要由下丘脑分泌，其功能是使机体适应应激刺激，调节内脏活动和情绪反应。中枢和肠道中CRF是急慢性刺激中的重要调节因子，其在应激与肠道疾病的相关性中起到重要作用。大鼠下丘脑的室旁核和蓝斑注射CRF，可显著促进结肠运动，使结肠的通过时间要缩短，粪便排出量可增加20倍〔9〕。在大鼠中枢注射CRF可以加剧结肠扩张诱导的内脏痛。外周静脉注射或腹腔注射 CRF 可刺激大鼠结肠传输和排便，引起水样腹泻。临床研究表明，人体外周注射CRF可以降低结肠扩张的痛阈及增加结肠运动，IBS患者脑-肠轴对 CRF 反应更加敏感〔10〕。本实验表明，给予急慢性联合应激建立的IBS模型大鼠体重下降、排便增加、运动减少和兴趣缺失，同时下丘脑和结肠CRF的表达均显著高于正常对照组，说明急慢性联合应激建立的IBS模型与下丘脑和结肠CRF的高表达有关。

IBS患者多数伴有心理精神障碍，抗抑郁药能明显减轻某些腹泻型IBS患者腹部不适的症状。阿米替林属于最经典且应用最广泛三环类抗抑郁药，在中枢，通过抑制边缘系统的异常激活，改善IBS患者腹痛症状〔3〕；在外周，阿米替林可通过抑制胃肠运动，缩短胃肠通过时间，改善患者的排便状况〔11〕，此外，阿米替林可改善IBS患者的焦虑抑郁症状，有助于减轻患者消化道症状。本实验结果表明，阿米替林预防应用可改善IBS模型大鼠的症状，增加体重，减少排便，恢复其运动和兴趣，同时可减少IBS模型大鼠下丘脑和结肠CRF的表达，说明阿米替林改善IBS模型大鼠的症状与下丘脑和结肠CRF的表达减少相关。以上提示阿米替林对IBS模型大鼠内脏高敏感的治疗作用，可能是通过降低肠道和中枢CRF的表达而产生，其作用机制可能与阿米替林对脑-肠轴的调节有关。

1 Canavan C，West J，Card T.The epidemiology of irritable bowel syndrome〔J〕.Clin Epidemiol，2014；6(1)：71-80.

2 Moloney RD，O′Mahony SM，Dinan TG，etal.Stress-induced visceral pain：toward animal models of irritable-bowel syndrome and associated comorbidities〔J〕.Front Psychiatry，2015；6：15.

3 Saha L.Irritable bowel syndrome：pathogenesis，diagnosis，treatment，and evidence-based medicine〔J〕.World J Gastroenterol，2014；20(22)：6759-73.

4 Fu J，Zhang Y，Wu R，etal.Shuganjieyu capsule increases neurotrophic factor expression in a rat model of depression〔J〕.Neural Regen Res，2014；9(5)：489-97.

5 Naliboff BD，Chang L，Munakata J，etal.Towards an integrative model of irritable bowel syndrome〔J〕.Prog Brain Res，2000；122：413-23.

6 LaBuda CJ，Little PJ.Pharmacological evaluation of the selective spinal nerve ligation model of neuropathic pain in the rat〔J〕.J Neurosci Methods，2005；144(2)：175-81.

7 Matsuzaki H，Shimizu Y，Iwata N，etal.Antidepressant-like effects of a water-soluble extract from the culture medium of Ganoderma lucidum mycelia in rats〔J〕.BMC Complement Altern Med，2013；13：370.

8 刘兆霞，季万胜，刘晓丽，等.Ucn3及其受体CRFR2在肠易激综合征大鼠模型肠神经系统中的表达〔J〕.世界华人消化杂志，2012；20(13)：1094-9.

9 Taché Y，Martinez V，Million M，etal.Stress and the gastrointestinal tract.Ⅲ.Stress-related alterations of gut motor function：role of brain corticotropin-releasing factor receptors〔J〕.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2001；280(2)：G173.

10 Martinez V，Wang L，Rivier JE，etal.Differential actions of peripheral corticotropinreleasing factor (CRF)，urocortin Ⅱ，and urocortin Ⅲ on gastric emptying and colonic transit in mice：role of CRF receptor subtypes 1 and 2〔J〕.J Pharmacol Exp Ther，2002；301(2)：611-7.

11 Vahedi H，Merat S，Momtahen S，etal.Clinical trial：the effect of amitriptyline in patients with diarrhoea-predominant irritable bowel syndrome〔J〕.Aliment Pharmacol Ther，2008；27(8)：678-84.

〔2016-01-19修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

山东省高等学校科技计划项目(No.J11LF33)

赵廷坤(1981-)，男，讲师，硕士，主要从事神经内分泌学研究。

R574.4

A

1005-9202(2017)13-3142-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.009