白芍总苷对脑缺血再灌注后细胞凋亡抑制作用的研究*

史晴晴于红梅

（河北省廊坊市第四人民医院，河北廊坊065700）

·研究报告·

白芍总苷对脑缺血再灌注后细胞凋亡抑制作用的研究*

史晴晴△于红梅

（河北省廊坊市第四人民医院，河北廊坊065700）

目的观察白芍总苷对脑缺血再灌注后神经细胞细胞凋亡的影响。方法设假手术组、模型组、白芍总苷低、中、高剂量组，每组20只大鼠；采用线栓法建立大鼠脑缺血再灌注模型。缺血2 h后再灌注，灌注前0.5 h灌胃给药。再灌注24 h后采用盲法进行神经功能评分，剥取脑组织后测定含水量和梗死体积，检测凋亡神经细胞，测定凋亡相关基因和蛋白表达。结果与模型组比较，白芍总苷中、高剂量组神经功能评分显著降低（P＜0.01）、神经功能明显改善，脑组织含水量和梗死体积均显著降低（P＜0.05或P＜0.01）；白芍总苷低、中、高剂量组神经细胞凋亡数量呈不同程度减少，其中白芍总苷中、高剂量组凋亡指数（AI）显著降低（P＜0.05或P＜0.01）；白芍总苷中、高剂量组促凋亡基因Bax表达显著下调、抑凋亡基因Bcl-2显著上调、Bcl-2/Bax值显著升高（P＜0.05或P＜0.01），促凋亡蛋白Caspase-3、NF-κB表达显著下调（P＜0.05或P＜0.01）。结论白芍总苷对脑缺血再灌注后神经细胞凋亡具有抑制作用，从而表现出一定的保护作用，调节凋亡相关基因和蛋白表达可能是其重要的作用机制。

白芍总苷细胞凋亡局灶性脑缺血再灌注

随着人口老龄化的加速以及高血压病、高脂血症等患病率的提高，缺血性脑卒中已经发展成为我国人民生命健康的主要威胁之一，紧急药物溶栓和介入手术是临床上的常用技术手段，但血管在通后所继发的“缺血再灌注”损伤仍严重影响着该类患者预后。Wang Y等研究发现继发性神经细胞凋亡是脑组织缺血再灌注损伤重要的病理基础，因此以抑制细胞凋亡为靶点研究新型药物，或许是降低缺血再灌注损伤的新途径［1］。白芍总皂苷作为中药白芍的主要药理活性成分具有多重的药理作用，如免疫抑制、抗氧化、抗炎等［2-3］。张华龙等发现在心肌缺血再灌注后细胞发生凋亡过程中给予白芍总苷能够显著抑制凋亡的发生，从而发挥心肌保护作用［4］。然而白芍总苷相同病因导致的神经细胞损伤是否具有相同作用鲜见文献报道，本研究将就这一问题进行观察。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物SD清洁级大鼠，雄性，体质量260～300 g，购自河北省实验动物中心。实验期间，动物自由饮水和进食，昼夜节律为12 h。

1.2 药剂与仪器白芍总苷胶囊（宁波立华制药有限公司）；TUNEL试剂盒（北京博奥森生物技术有限公司）；Caspase-3、NF-κB单克隆抗体（碧云天生物技术有限公司）。

1.3 造模与分组模型制备与给药，应用随机数字表法将100只实验动物分为假手术组、模型组与白芍总苷低、中、高剂量组，每组20只大鼠；采用线栓法建立脑缺血再灌注大鼠模型［5］；假手术组行手术通路但不插入栓线；缺血2 h后再灌注，于再灌注前30 min灌胃给药，白芍总苷低、中、高剂量组分别给予50、100、200 mg/kg白芍总苷溶液灌胃；假手术组和模型组同步灌胃给予等体积0.9％氯化钠注射液。

1.4 观察指标神经功能评分于再灌注24 h后进行，参照10分制评分方法行盲法评分。脑组织含水量和梗死体积的测定，分别记录脑组织湿重（W）与干重（D），脑含水量（％）=［（W-D）/W］×100％；大脑组织沿冠状切片，厚度约2 mm，置于2％的2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色液中避光孵育0.5 h（梗死区呈苍白色），运用图像分析软件计算大脑组织梗死百分比。TUNEL染色法观察神经细胞凋亡状况。RT-PCR法检测Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达。Western blotting法测定Caspase-3、NF-κB蛋白表达。

1.5 统计学处理应用SPSS17.0统计软件。计量资料以（±s）表示，两组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠神经功能缺损程度评分、脑组织含水量及梗死体积比较见表1。模型组大鼠各指标较假手术组均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，白芍总苷中、高剂量组神经功能评分、脑组织含水量和梗死体积百分比均显著降低（P＜0.05或P＜0.01）。

2.2 各组大鼠脑组织细胞凋亡状况比较见表2。模型组大鼠脑组织凋亡细胞数量较假手术组明显增多；白芍总苷各组脑组织细胞凋亡数量较模型组呈不同程度减少，其中以白芍总苷高剂量组最为显著，结果见图1。凋亡指数（AI）计算结果显示模型组大鼠脑组织细胞AI较假手术组显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，白芍总苷中、高剂量组AI显著降低（P＜0.01）。

表1 各组大鼠神经功能缺损程度评分、脑组织含水量及脑组织梗死体积比较（±s）

表1 各组大鼠神经功能缺损程度评分、脑组织含水量及脑组织梗死体积比较（±s）

与假手术组比较，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

组别n脑含水量（％）神经评分（分）脑梗死体积（％）假手术组2077.9±1.4模型组2086.1±1.9**0.0±0.00.0±0.0 8.5±0.9**27.9±2.8**白芍总苷低剂量组2084.3±2.2 8.1±1.225.2±3.4白芍总苷中剂量组206.3±0.8△△21.5±2.6△80.7±1.8△白芍总苷高剂量组2078.4±2.0△△4.8±0.5△△17.9±2.1△△

图1 各组大鼠神经细胞凋亡状况（TUNEL，400倍）

表2 各组大鼠神经细胞AI比较（±s）

表2 各组大鼠神经细胞AI比较（±s）

组别n假手术组20模型组20白芍总苷低剂量组20 AI（％）4.3±1.7 57.6±8.4**51.2±10.9白芍总苷中剂量组2028.1±6.3△△白芍总苷高剂量组2022.7±5.9△△

2.3 各组大鼠脑组织Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达结果比较见表3。模型组mRNA表达较假手术组均显著上调（P＜0.05或P＜0.01），Bcl-2/Bax值显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，白芍总苷中、高剂量组Bcl-2 mRNA表达显著上调且Bax mRNA显著下调（P＜0.05或P＜0.01），Bcl-2/Bax值显著升高（P＜0.01）。

2.4 各组大鼠脑组织Caspase-3、NF-κB蛋白表达比较见图2和表4。模型组脑组织Caspase-3、NF-κB蛋白表达较假手术组均显著上调（P＜0.01）；而与模型组比较，白芍总苷中、高剂量组Caspase-3、NF-κB均显著下调（P＜0.05或P＜0.01）。

表3 各组大鼠Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达及Bcl-2/Bax值比较（±s）

表3 各组大鼠Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达及Bcl-2/Bax值比较（±s）

组别nBcl-2/Bax Bcl-2（×10-3）Bax（×10-3）假手术组200.49±0.21模型组200.34±0.15**30.9±5.863.1±14.8 37.4±9.5*109.5±22.6**白芍总苷低剂量组200.42±0.23 43.1±10.9100.8±19.2白芍总苷中剂量组2054.6±13.0△88.5±17.4△△0.62±0.29△△白芍总苷高剂量组200.84±0.36△△61.3±12.7△△73.0±15.6△△

图2 各组大鼠脑组织NF-κB、Caspase-3蛋白表达

表4 各组大鼠脑组织中Caspase-3、NF-κB蛋白表达比较（±s）

表4 各组大鼠脑组织中Caspase-3、NF-κB蛋白表达比较（±s）

组别n Caspase-3/β-actinNF-κB/β-actin假手术组20模型组20 0.16±0.040.13±0.07 0.63±0.19**0.48±0.17**白芍总苷低剂量组200.54±0.230.40±0.15白芍总苷中剂量组200.44±0.18△0.32±0.12△白芍总苷高剂量组200.23±0.15△△0.27±0.09△△

3 讨论

流行病学显示，缺血性脑血管疾病发病率逐年上升，而其致死率仍居高不下，严重危害着人类的生命健康。采用及时溶栓以恢复血流再灌注能够挽救部分“缺血半暗带区域”神经细胞。“缺血再灌注损伤”并发症对神经元造成的损伤严重影响着患者预后。这是个复杂的损伤级联反应，Wang Y等研究发现继发性神经细胞凋亡是脑组织缺血再灌注损伤重要的病理机制［1］。

细胞凋亡是一种细胞程序化死亡过程，由多种基因参与调控，其中B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）为抑凋亡基因而Bcl-2相关X蛋白（Bax）是促进凋亡的基因，两者相辅相成共同调节细胞凋亡过程［6］；Bcl-2不仅对线粒体损伤具有直接的保护作用，还间接抑制促凋亡调控蛋白Caspase-3激活［7］、抑制Bax细胞毒性作用，从而表现出对细胞凋亡的抑制作用［8］；Bax能够破坏线粒体渗透性而导致细胞色素C释放增加、激活Caspase-9，表现出对细胞凋亡的促进作用；因此Bax/ bcl-2值更加能够体现Bax和bcl-2对细胞凋亡的调控作用［9］。NF-κB是一种多效能核转录因子，Zhang Q等研究发现，NF-κB的激活可以促进巨噬细胞功能如吞噬和浸润等，从而激活凋亡信号，最终导致细胞的凋亡［10］。然而，在正常情况下核转录因子NF-κB已无活性状态存在于胞质中，当受到刺激激活形成多聚体，并发生核转位，入核发挥生物学效应，诱导促凋亡信号释放而导致细胞凋亡［10-15］。

本实验研究结果显示，白芍总苷100～200 mg/kg能够显著改善大鼠脑缺血再灌注损伤所导致的神经功能障碍、减少脑组织的含水量并显著减少脑组织梗死范围。TUNEL染色结果显示：白芍总苷能够抑制脑缺血再灌注大鼠脑组织细胞凋亡并显著降低AI，上调抑凋亡基因的表达，同时下调促凋亡基因表达。结果提示白芍总苷对脑缺血再灌注损伤的抑制作用，可能是通过改善神经细胞凋亡来实现的，调节凋亡相关基因和蛋白表达可能是其重要的作用机制。

［1］Wang Y，Zhen Y，Wu X，et al.Vitexin protects brain against? ischemia/reperfusion injury via modulating mitogen-activated protein kinase and apoptosis signaling in mice［J］.Phytomedicine，2015，22（3）：379-384.

［2］李艳梅.白芍总苷佐治系统性红斑狼疮的临床效果观察［J］.临床合理用药，2013，8（6）：68-69.

［3］蒋午峻，王巧，李小娜，等.白芍总苷的药理作用和质量控制方法研究进展［J］.河北医科大学学报，2006，27（5）：500-502.

［4］张华龙，张友良，魏庆民.白芍总苷对大鼠心肌缺血再灌注损伤后心肌细胞凋亡的影响［J］.中药药理与临床，2015，31（4）：79-83.

［5］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in the rats［J］. Stroke，1989，20（1）：84-91.

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Inhibitory Effects of Total Glucosides of Paeony on Apoptosis in the Rats with Cerebral Ischemia-reper-fusion

SHI Qingqing，YU Hongmei.The Fourth People’s Hospital of Langfang，Hebei，Langfang 065700，China.

Objective：To study the inhibitory effects of total glucosides of paeony（TGP）on neuronal apoptosis in the rats with cerebral ischemia-reperfusion injury.Methods：The rats were divided into the sham group，the model group，and TGP（50，100，200 mg/kg）groups，20 rats in each.The model of focal cerebral ischemic reperfusion was established with Zea-longa occluding suture；0.5h before reperfusion，the drugs were given by intragastric administration.Twenty-four hours after reperfusion，the neurological deficits，ratio of infarct volume，water content of the brain were evaluated；the neurocyte apoptosis were observed and Apoptosis Index（AI）was determined；the expression of bcl-2 mRNA，Bax mRNA and caspase-3，NF-κB protein were detected.Results：Compared with the model group，the neurological scores of TGP medium，high-dose groups decreased significantly（P＜0.01）；neurological function improved significantly；the ratio of infarct volume and brain water content decreased significantly（P＜0.05 or P＜0.01）；the neurocyte apoptosis of TGP groups were significantly improved；and AI of TGP medium，high-dose groups decreased significantly；the expression of bcl-2 mRNA was significantly up-regulated and the expression of Bax mRNA was significantly down-regulated；the ratio of bcl-2/Bax was significantly increased；the expression of caspase-3，NF-κB protein was significantly down-regulated（P＜0.05 or P＜0.01）.Conclusion：TGP can reduce focal cerebral ischemia reperfusion injury by inhibiting neuronal apoptosis and shows a certain protection.Regulating the expression of apoptosis related genes and proteins may be an important mechanism.

TGP；Apoptosis；Focal；Cerebral ischemia-reperfusion

R743.9

A

1004-745X（2017）06-0973-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.06.010

2017-03-01）

河北省廊坊市科技支撑计划项目（2016013151）

△通信作者（电子邮箱：lfsysqq@163.com）