L e t-7c-1对戊四氮致痫大鼠学习记忆功能的作用☆

廖亚云刘夕霞黄逸青廖宇晗吴原○☆

·论著·

L e t-7c-1对戊四氮致痫大鼠学习记忆功能的作用☆

廖亚云*刘夕霞△黄逸青※廖宇晗*吴原*○☆

目的研究let-7c-1对戊四氮（pentylenetetrazol，PTZ）致痫大鼠学习记忆功能的影响，探讨其可能机制。方法通过PTZ腹腔注射SD雄性大鼠建立慢性癫痫模型，随机分为癫痫组、干预对照组、let-7c-1激动剂组，各组12只，另设12只大鼠为正常组。28 d后，观察各组大鼠的行为学变化，let-7c-1基因表达及大鼠海马组织中Bcl-2、Caspase3蛋白的表达。结果与正常组相比，癫痫组大鼠逃避潜伏期延长、穿越平台次数减少、在目标象限的总路程缩短，差异有统计学意义（P<0.05）；癫痫组与干预对照组相比，逃避潜伏期、穿越平台次数、在目标象限的总路程无统计学差异（P>0.05）；与干预对照组相比，let-7c-1激动剂组逃避潜伏期明显延长，穿越平台次数减少、在目标象限的总路程缩短，差异有统计学意义（P<0.05）。干预对照组与let-7c-1激动剂组let-7c-1基因相对表达量分别为（1.35±0.32）、（62.53±21.01）（F=50.97，P<0.05）。癫痫组let-7c-1基因表达量高于正常组，差异有统计学意义（P<0.05）。let-7c-1激动剂组let-7c-1基因表达量明显高于干预对照组、癫痫组及正常组，差异有统计学意义（P<0.05）。与正常组相比，癫痫组的Bcl-2蛋白表达减少，Caspase3蛋白表达增加，差异有统计学意义（P<0.05）；癫痫组与干预对照组相比，Bcl-2蛋白及Caspase3蛋白的表达无统计学差异（P>0.05）。与干预对照组相比，let-7c-1激动剂组Bcl-2蛋白表达明显减少，Caspase3蛋白表达明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）。结论Let-7c-1可能通过减少海马组织Bcl-2蛋白及增加Caspase-3蛋白表达使PTZ致痫大鼠的学习记忆功能受损。

癫痫学习记忆功能凋亡

研究表明一些在脑及血液中特异表达的microRNA参与癫痫、脑卒中引起的大鼠海马损伤[1]。MicroRNA与记忆障碍密切相关[2]，可通过影响神经元的发生和发育调控大鼠的学习和记忆功能[3]。let-7是mircroRNAs的重要成员，研究发现在难治性癫痫患者脑组织中let-7c基因表达上调[4]。我们在对PTZ致痫大鼠记忆障碍的前期研究也发现let-7c-1表达明显上调[5]。一项对阿尔茨海默病的研究发现let-7c通过上调BACE2分泌酶减少Аβ的生成[6]，癫痫伴阿尔茨海默病的患者其认知功能障碍的发生有着共同的microRNA异常表达基础[7]。let-7与癫痫相关，是否同时对认知功能有影响，我们尚不清楚。本实验拟采用PTZ致痫大鼠模型，探讨let-7c-1对PTZ致痫大鼠学习记忆功能的作用。

1 材料与方法

1.1 动物分组及模型建立SD成年雄性大鼠，体重约220～240 g，由广西医科大学动物实验中心提供（实验动物通过伦理委员会审核）。将大鼠随机分为4组：正常组（腹腔注射生理盐水）、癫痫组（腹腔注射PTZ）、干预对照组（腹腔注射PTZ+侧脑室注射let-7c-1-3 p agomir control）、let-7c-1激动剂组（腹腔注射PTZ+侧脑室注射let-7c-1-3 p agomir），每组12只。造模成功后，立即进行水迷宫实验。水迷宫实验后第2天每组各随机取6只大鼠的新鲜脑组织用于PCR实验，另外6只经多聚甲醛心脏灌注后取海马组织制作成石蜡切片，用于免疫组化实验。

1.2 癫痫动物造模的给药方式取SD大鼠，腹腔注射PTZ（美国Sigma公司，生理盐水配置成10 mg/mL）60 mg/kg后观察大鼠行为20 min，根据Racine分级标准[8]进行观察及记录，选择IV～V级致痫大鼠作为癫痫动物模型组。将大鼠麻醉固定在立体定位仪上，参照大鼠脑立体定位图谱[9]定位大鼠右侧侧脑室，暴露前囟，以前囟为原点往后0.8 mm，中线向右旁开1.3mm，用5mL注射器针头钻开颅骨，硬膜下3.7mm，用10μL微量注射器将let-7c-1-3 p agomir control、let-7c-1-3 p agomir、（广州市锐博生物科技有限公司，生理盐水配置成1 nmol/5μL）以1μL/5min速度泵入干预对照组，let-7c-1激动剂组大鼠侧脑室，剂量为每只1 nmol，注射后留针10min缓慢退出，消毒、缝合。随后用PTZ（35 mg/kg）腹腔注射点燃，观察20min，隔天1次，共14次，持续28 d。取期间连续4次发作达II级或2次发作达IV～V级作为慢性癫痫模型[5]。

1.3 M orris水迷宫实验Morris水迷宫[10]由定位航行实验及空间探索实验组成，共6 d，分析大鼠的学习和记忆功能。其中定位航行实验历时5 d，记录90 s内找到平台的时间（即逃避潜伏期）。空间探索试验在第6天撤去平台时进行，记录90 s内穿越原平台次数和在目标象限（原平台象限）的总路程。

1.4 RT-PCR荧光定量实验实验步骤：①总RNA的提取和CDNA的合成：冰上分离海马组织，用Trizol reagent提取总RNA，分光光度仪测定所提RNA纯度及完整性；参照逆转录试剂盒（宝生物工程大连有限公司）说明书对CDNA的合成进行操作，反应体系20μL，将反转录的CDNA冰上冷却后，-20℃冰箱中保存备用。②RT-PCR反应：选择SYBR染料法，在ABI7500型荧光定量PCR仪（型号：Applied Biosystems AB）进行RTPCR反应，以U6基因（大连宝生物工程有限公司）作为对照基因。具体反应体系按说明书操作。分析观察RT-PCR的扩增和融解曲线，用相对定量2-ΔΔCt分析大鼠海马组织中let-7c-1的相对表达量。

1.5 免疫组织化学①将大鼠脑组织制作成4μm厚石蜡切片；②采用SP法（SP试剂盒北京中衫金桥生物技术有限公司）：经脱蜡、脱水、高压抗原修复、血清封闭后，滴加一抗Bcl-2（稀释度1:100）（英国abcam公司）或者一抗Caspase3（稀释度1: 300）（santa公司），置于37℃湿盒内过夜（12～16 h），复温、清洗，滴加通用型兔抗羊二抗，PBS清洗，滴加辣根酶标志链霉素卵白素孵育15 min，DAB显色，苏木精复染，浸泡返蓝，中性树胶封片；③在高倍镜（40×10）（日本奥林巴斯有限公司）下随机选取6个不同视野观察并拍照，采用IPP软件进行半定量分析，检测阳性细胞的平均荧光密度值。

1.6 统计学方法采SPSS16.0进行统计学处理，数据结果以±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用最小显著性差异法进行，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 模型建立癫痫动物模型腹腔注入PTZ后约4min出现面部抽搐，随后出现单肢、多肢抽搐、全身强直、跌倒等症状，持续时间约1～3min。造模的SD大鼠共有42只，36只造模成功，86％大鼠出现癫痫样症状并达Ⅳ～Ⅴ级发作，点燃期间100％大鼠连续4次发作达II级或2次发作达IV～V级。正常组腹腔注入生理盐水后无痫性发作。

2.2 大鼠M orris水迷宫检测结果在定位航行实验中，随着训练时间延长，各组的逃避潜伏期逐渐缩短，大鼠的记忆能力越强。水迷宫试验结果见表1、表2。癫痫组大鼠的学习记忆功能较正常组明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；经侧脑室注射let-7-1激动剂，大鼠的学习记忆功能较干预对照组明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。实验表明过表达let-7-1可使PTZ致痫大鼠学习记忆功能受损。

2.3 let-7c-1基因表达采用荧光定量PCR对let-7c-1基因表达进行检测，结果显示正常组、癫痫组、干预对照组、let-7-1激动剂组的let-7c-1基因相对表达量分别是：1.00±0.00、1.48±0.32、1.35±0.32、62.53±21.01（F=240.43，P<0.05）。let-7 c-1激动剂组let-7c-1基因的表达均比正常组、癫痫组及干预对照组高，差异均具有统计学意义（P<0.05）；实验溶解曲线及扩增曲线见图1。

2.4 Bcl-2、Caspase3蛋白表达各组大鼠Bcl-2和Caspase3蛋白的表达见图2。Bcl-2蛋白主要在神经元胞浆内表达，Caspase3蛋白在神经元胞浆及胞核都有表达。各组Bcl-2蛋白的相对表达量分别为：0.1609±0.00608、0.1025±0.00529、0.1017± 0.00278、0.0607±0.00407（F=76.20，P<0.05）；Caspase3蛋白的表达量分别为0.0931±0.00234、0.1196±0.00221、0.1215±0.00276、0.1576±0.00165（F=35.70，P<0.05）。经统计，Bcl-2蛋白光密度依次为：正常组>癫痫组>let-7c-1激动剂组，组间差异均具有统计学意义（P<0.05）；Caspase3蛋白光密度依次为：正常组<癫痫组0.05）。

表1 不同时间点各组大鼠逃避潜伏期比较（s）（n=12）

表2 各组大鼠第6天时穿越平台次数及在目前象限的总路程比较（n=12）

3 讨论

图1 左图为各组R T-P CR实验溶解曲线图，U6及le t-7c-1基因只有单峰，为特异性扩增；右图为U6及le t-7c-1基因扩增曲线图：参考基因及目的基因扩增效率具有一致性

图2 左图大鼠海马组织中B c l-2蛋白及C aspas e3蛋白表达情况（40×），A为正常组，B为癫痫组，C为干预对照组，D为le t-7c-1激动剂组；右图表示与正常组相比，P＜0.05

癫痫患者存在不同程度的认知功能障碍。研究表明，microRNA表达和功能的异常与癫痫的学习、记忆障碍等疾病都有密切的关系。既往发现癫痫大鼠存在记忆障碍[11]。本实验研究证实，与正常对照组比较，癫痫组学习记忆功能受损。我们前期研究[5]发现，在PTZ致痫大鼠认知功能障碍大鼠中let-7c-1过表达。本实验通过建立PTZ致痫大鼠模型研究let-7c-1过表达对PTZ致痫大鼠认知功能的影响。结果表明，通过侧脑室注射let-7c-1激动剂，可以使癫痫动物模型let-7c-1基因过表达；另外癫痫组let-7c-1基因表达量高于正常组。认知功能方面，与干预对照组相比，let-7c-1激动剂组学习记忆能力明显下降。大鼠学习记忆能力下降趋势与let-7c-1表达趋势一致。结果提示过表达let-7c-1可使PTZ致痫大鼠的学习记忆功能损害。

研究证实在癫痫动物模型中存在海马区神经元凋亡现象[12]。近来研究表明癫痫发作后部分神经元凋亡由Bcl-2、Bax等凋亡基因调控。Bcl-2蛋白通过调节线粒体膜的通透性，最终抑制细胞凋亡。Caspase3是一种蛋白酶，其表达上调表明凋亡通路被激活，细胞死亡增加。本实验通过制作慢性癫痫动物模型发现，癫痫组海马组织细胞凋亡比正常组增多，Bcl-2蛋白表达明显减少，Caspase3蛋白表达显著增加，这与前期研究相一致。

经相关实验提示细胞凋亡受基因调控。let-7c在脑血管疾病、神经免疫系统疾病等疾病中的表达明显上调。LIU等[13]发现let-7在脑损伤后的高表达与细胞凋亡有关。在本实验研究中，侧脑室注射let-7c-1激动剂使let-7c-1在脑组织中过表达，发现海马区神经元凋亡显著增加，Bcl-2蛋白表达明显减少，Caspase3蛋白表达显著增加，研究证明在癫痫动物模型中，let-7c-1激动剂可通过减少Bcl-2蛋白表达，增加Caspase3蛋白表达导致海马区凋亡增加。

研究发现Bcl-2、Bcl-xl、Fas和Caspase-3蛋白等let-7家族的靶基因与凋亡相关[14-15]。细胞凋亡的线粒体通路是癫痫致神经元损伤的重要途径，既往发现Caspase3参与了痫性放电致神经元凋亡的过程[16]，通过实验结果分析我们推测let-7 c-1使癫痫大鼠的学习记忆功能受损与线粒体细胞凋亡途径相关。但本实验未进行细胞凋亡通路相关因子的检测，有待进一步证实。

综上所述，let-7c-1负向调节PTZ致痫大鼠的学习记忆功能，过表达let-7c-1可通过减少Bcl-2蛋白的表达和增加Caspase3蛋白表达使癫痫大鼠海马组织的细胞凋亡增加。let-7c-1可能为癫痫致学习记忆功能障碍的一个干预靶点。

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The effects of let-7c-1 on the learning and memory of epileptic rats induced by PTZ.

LIAO Yayun,LIUXixia,HUANG Yiqing,LIAO Yuhan,WU Yuan.Department of Neurology,the First Affiliated Hospital,Guangxi Medical University,Nanning 530021,China.Tel:0771-5356504.

Objective To explore the effect of let-7c-1 on the learning and memory of PTZ-induced epileptic rats and its relevantmechanism.Methods A model of temporal lobe epilepsy(TLE)was induced via PTZ kindling in SD male rats.The epileptic rats were divided into epilepsy group,agomir-control group,let-7c-1 agomir group(12 rats for each).Twelve rats were served as a negative control group.The behavior and the expression levesl of let-7c-1,Bcl-2 protein and Caspase3 were evaluated at 28 days following PTZ.Results Compared to the negative group, the escape latency of epilepsy group was prolonged and the crossing times as well as the quadrant total distance in the target were reduced(P<0.05).However,those parameters were not significantly different between the epilepsy groupand the agmoir-control group(P＞0.05).Compared to the agmoir-control group,the escape latency of let-7c-1 agomir group was prolonged and the crossing times as well as the quadrant total distance in the target were reduced(P＜0.05).The expression levels of let-7c-1 and let-7c-1 were 1.35±0.32 in agmoir-control group and 62.53±21.01 in agomir group（F=50.97，P＜0.05）.The expression levels of let-7c-1 were higher in let-7c-1 agomir group than in other groups（P＜0.05）.Compared to the negative group,the expressions of Bcl-2 protein in other groups were decreased(P＜0.05)and the Caspase3 protein were increased(P＜0.05).Compared to the agomir-control group,the expression of Bcl-2 protein was significantly decreased and the expression of Caspase3 protein was significantly increased in let-7c-1 agomir group(P＜0.05).Conclusions The present study shows that let-7c-1 may impair the learning and memory of PTZ-induced epileptic rats through decreasing the Bcl-2 protein and increasing Caspase3 protein in the hippocampus.

Epilepsy Learning andmemory Apoptosis

R742.1

A

2016-08-27）

（责任编辑：李立）

10.3969/j.issn.1002-0152.2017.04.010

☆国家自然科学基金（编号：81360201）

*广西医科大学第一附属医院神经内科（南宁530021）

△广西壮族自治区人民医院康复医学科

※广西贵港市人民医院神经内科

○☆通信作者（E-mail:wuyuan90@126.com）