广西扶绥县肝癌高危人群HBV S区基因突变与原发性肝癌的相关性研究

甘膺元邓伟黄天壬吴杭航黄月莹张玉丽

作者单位：530021南宁1广西医科大学附属肿瘤医院实验研究部；2广西医科大学研究生院

广西扶绥县肝癌高危人群HBV S区基因突变与原发性肝癌的相关性研究

甘膺元1，2邓伟1黄天壬2吴杭航1，2黄月莹1，2张玉丽1，2

作者单位：530021南宁1广西医科大学附属肿瘤医院实验研究部；2广西医科大学研究生院

目的探讨广西扶绥县肝癌高危人群乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）S区基因突变及其与原发性肝癌（primary liver cancer，PLC）的关系。方法收集来自扶绥县肝癌高危人群队列30例原发性肝癌患者为病例组，同时在队列中按条件收集30例未发生肝癌的持续HBsAg阳性者为对照组，两组1∶1匹配，收集血清标本。采用巢式PCR方法扩增出HBV S区基因片段，对扩增产物进行测序分析。结果病例组和对照组突变率差异有统计学意义的突变点为T140A、T140C、T300C、G620A（P＜0.05）；条件logistic回归分析显示，T140C突变可能降低原发性肝癌发病风险（OR＝0.484，95%CI：0.239～0.994），T300C突变可能增加原发性肝癌发病风险（OR＝2.911，95%CI：1.110～7.629）。结论与原发性肝癌发生相关的HBVS区基因突变位点有T140A、T140C、T300C和G620A，其中T140C、T300C与原发性肝癌发生有独立相关性。

肝肿瘤；乙型肝炎病毒；S基因；基因突变；病例对照研究

原发性肝癌（primary liver cancer，PLC）是常见的恶性肿瘤之一，广西是我国肝癌高发地区，据统计，2013年广西肝癌发病率高达41.66/10万，死亡率达34.66/10万［1］。扶绥县是广西肝癌发病率和死亡率较高的地区之一，而HBV感染是该地区肝癌高发的重要因素。HBV属嗜肝DNA病毒科病毒，其DNA由负链和正链组成，负链含4个开放读码框架，分别为前S/S基因区、前C/C基因区、P基因区和X基因区，其中HBV S区基因序列包括第155～833位核苷酸，编码226个氨基酸。其中亲水区（majorhydrophilic region，MHR）位于nt.100～169，为S区基因常出现突变的片段。研究发现该片段发生突变易造成免疫逃逸，导致病情加重、预后不良，而在MHR外的sW172突变者较未突变者肝癌发生率显著增高［2］。但目前对广西扶绥县肝癌发生与S区基因突变的相关性研究较少，本研究探讨HBV S区基因突变与PLC相关性，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象

所有研究对象均来自广西扶绥县肝癌高发区肝癌高危人群随访队列，该队列由早期全人群筛查后检测为HBsAg阳性但未发生肝癌者组成，其中病例组为队列中连续5年（2011～2015年）随访检测结果HBsAg均阳性的（半年检测1次）PLC新发病例30例，年龄30～65岁，诊断符合中国抗癌协会肝癌专业委员会2015年修订的《原发性肝癌规范化病理诊断指南》；对照组选择标准为该队列中与病例组同村、同性别、年龄相差2岁以内但未发生癌变的持续5年检测为HBsAg阳性者，与病例组进行1∶1匹配。病例组和对照组的HBV基因型均要求为C型，基因型根据S区核苷酸序列测序结果，采用NCBI在线病毒基因分型工具确定［3］。收集病例组和对照组血清标本，置-80℃冰箱备用。

1.2 HBV DNA的提取

血清HBV DNA提取试剂盒购于上海天根生化科技公司，提取过程严格按照试剂盒说明书操作。

1.3 HBV S区基因的PCR扩增

引物合成和Taq酶购自宝生物工程有限公司。HBV DNA基因扩增采用巢式PCR方法，第一轮反应引物序列：上游引物为5′-GGGTCACCATATTCTTGGG-3′，下游引物为5′-GACCCACAATTCTTTGACAT-3′；第二轮反应引物序列：上游引物为5′-GCGGGGTTTTTCTTGTTGA-3′，下游引物为5′-GGGACTCAAGATGTTGTACAG-3′。PCR反应体系总体积为50μL，含DNA模板3μL，上下游引物各1μL，Premix Taq 25μL，加入ddH2O补足至50μL。PCR反应条件：第一轮：95℃预变性3 min；94℃变性15 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30个循环；72℃终末循环10 min；第二轮反应退火温度为58℃，其他反应条件同第一轮PCR反应条件。取产物7μL进行琼脂糖凝胶电泳，产物目的基因长度为586 bp。

1.4 HBV S区基因PCR扩增产物测序及结果分析

PCR扩增产物由北京六合华大基因科技股份有限公司广州分公司测序，返回的结果采用Mutation Surveyor V4.0.5软件与GenBank上的NC_003977.2进行比对分析。

1.5 统计学处理

采用SPSS 23.0软件对数据进行统计学分析。两组研究对象配对采用单因素配对χ2检验或确切概率法，单因素分析结果有意义的突变点进行多因素条件logistic回归分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料比较

病例组和对照组的性别、年龄、ALT、DNA拷贝数等一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 两组一般资料比较［n（%）］

2.2 HBV S区基因的PCR扩增及测序结果

扩增产物凝胶电泳结果显示，7份样本PCR产物中，6份通过凝胶电泳在586 bp处出现亮条带，与目的片段长度相符，3号样本因产物浓度过低未见相应电泳条带，见图1。将S区扩增产物与GenBank上的NC_003977.2进行比对，结果显示突变率较高的位点有33个，部分结果如图2所示，该图为对照组编号24的标准序列300号碱基T突变为C，相邻位点未出现突变。

2.3 HBV S区基因突变点

测序结果显示，HBV S区共有33个碱基位点发生突变，其中病例组和对照组突变频率均较高（≥50%）的有A133G、T135A、A136C、T146C、C203T、A328C、T337A、C339A、C364A、G365A、T374C、A378C、A401C、C408T、C420A、C444T、C465T、G476C、A479G、C503T，两组均较低（＜50%）的有T213C、C246A、A345T、C348A、C377T、A390C、T530C，两组突变率相差较大（相差＞30%）的有G139A、T140A、T140C、C158T、T300C、G620A。

图1 HBV S区基因扩增产物电泳图

图2 对照组编号24部分测序结果分析图

2.4 HBV S区基因突变的单因素分析

在33个发生突变的基因位点中，病例组和对照组T140C、T140A、T300C、G620A突变点的突变率差异有统计学意义（P＜0.05），其中病例组T140A、T300C突变点的突变率高于对照组，T140C、G620A突变率低于对照组。见表2。

2.5 多因素条件logistic回归分析结果

logistic回归分析结果显示，T140C突变可能降低PLC的发病风险（OR＝0.484，95%CI：0.239～0.994）；T300C突变可能增加PLC的发病风险（OR＝2.911，95%CI：1.110～7.629）。见表3。

表2 HBV S区基因突变单因素分析

表3 HBV S区基因突变多因素条件logistic回归分析

3 讨论

肝癌的发生是一个多因素、多基因参与和调控的复杂过程，HBV慢性持续感染是PLC发生的重要因素。HBV是高度变异的DNA病毒，基因突变发生较频繁，研究发现75.9%的HBV再活化患者中携带超过1种HBsAg突变体［4］，分析优势基因型中毒株的基因突变可能有助于寻找PLC发生的病因。国内外研究中，与HBV S区相关的基因突变所引起的氨基酸改变主要发生于“a”抗原决定簇内（第124～147AA寡片段）［5］，该区段内突变可能改变膜蛋白构象，影响抗原性而不能形成诱导性抗体，从而引起免疫逃避［6-7］，发生隐匿型HBV感染（occult hepatitis B virus infection，OBI）［8］，其中较常见的突变有126、145位氨基酸突变［9-11］。亦有研究指出G145R单一突变引起免疫逃避的风险不高，需其他氨基酸（如T116N、P120S/E、Q129H等）发生突变产生协同作用，才能增加风险［12］。此外，碱基突变可使终止密码子提前出现和HBV S区部分片段缺失，影响HBsAg表达、合成和分泌，从而影响OBI发展［13-16］。

本研究结果发现病例组和对照组中126位苏氨酸的核苷酸位点C377T突变率相同，说明扶绥县肝癌高危人群中HBV 126位苏氨酸突变与PLC的发生无相关性，这和其他地区的研究结果不一致。钱福初等［17］研究发现HBV S区基因突变尤其是MHR出现突变，可能增加严重肝脏疾病的发生率，其中与126位氨基酸突变的相关性最强。地区优势基因差异可能是造成与本研究结果不同的原因。

本研究结果还显示，T140A、T140C、T300C和G620A突变与扶绥县肝癌高危人群发病有相关性，其中T300C突变在MHR内，该突变在独立风险分析中显示与PLC发病风险呈正相关（OR＝2.911），提示其可能增加HBsAg持续阳性者发生PLC的风险，但该位点突变的发生在国内尚未有报道，或许能为研究扶绥县免疫逃避等因素对PLC发生发展的影响提供新的思路。另外，T140C突变导致47位缬氨酸突变为丙氨酸，在独立风险分析中提示该突变可能降低扶绥县肝癌高危人群的发病风险，但该位点突变的出现是否与队列人群的药物干预、临床治疗相关，尚需进一步调查研究。

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［2017-02-21收稿］［2017-03-25修回］［编辑罗惠予］

A case-control study of association between hepatitis B virus S genemutation and primary liver cancer

Gan Yingyuan1，2，Deng Wei1，Huang Tianren2，Wu Hanghang1，2，Huang Yueying1，2，Zhang Yuli1，2（1Department of Research，Affiliated Tumor Hospital of GuangxiMedical University，2Graduate School of GuangxiMedical University，Nanning 530021，P.R.China）

Huang Tianren.E-mail：tianrenhuang@sina.com

Liver neoplasm；Hepatitis B virus；Sgene；Genemutation；Case-control study

R735.7

A

1674-5671（2017）03-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2017.03.04

国家自然科学基金资助项目（81260319）；广西高校科学技术研究资助项目（KY2015ZD025，ZD2014039，2013ZD016）

黄天壬。E-mail：tianrenhuang@sina.com

【Abstract】Objective To study potential associations between mutations in hepatitis B virus（HBV）S gene and risk of primary liver cancer（PLC）in FuSui county of the Guangxi Zhuang Autonomous Region.M ethods A total of 30 new cases of PLC from individuals at high PLC risk in FuSui（based on HBsAg positivity lasting from 2011 to 2015）werematched with 30 controlswithout cancer.The S genewas amplified from DNA in serum by nested PCR and sequenced directly.Results were analyzed by chi-squared test，Fisher's exact test and conditional logistic regression.Results Frequencies of themutations T140A，T140C，T300C and G620A differed significantly between cases and controls（P<0.05）.Logistic regression linked T140C to significantly lower risk of PLC（OR 0.484，95%CI：0.239-0.994）and T300Cwith significantly higher risk of PLC（OR 2.911，95%CI：1.110-7.629）.Conclusion T140C and T300C are independent predictors of PLC，with T140C an apparent protective factor and T300C an apparent risk factor.