CD90和CD44分子在人肝癌组织中的表达

周四莲匡志鹏

作者单位：530021南宁广西医科大学附属肿瘤医院实验研究部

CD90和CD44分子在人肝癌组织中的表达

周四莲匡志鹏

作者单位：530021南宁广西医科大学附属肿瘤医院实验研究部

目的探讨肝癌干细胞标志物CD90和CD44分子在人肝癌组织中的表达。方法采用实时荧光定量PCR和免疫组化法检测40例人肝癌组织及其40例相应远端癌旁组织中CD90和CD44基因mRNA和蛋白的表达。结果CD90和CD44基因mRNA在肝癌组织中的表达高于远端癌旁组织，差异有统计学意义（P＜0．05）；CD90和CD44阳性分子定位于癌细胞膜与细胞浆，CD90和CD44细胞在肝癌组织中的阳性表达率分别为82．5%（33/40）和77．5%（31/40），在远端癌旁组织中分别为17．5%（7/40）和12．5%（5/40），两者差异均有统计学意义（P＜0．05）。结论CD90和CD44分子在人肝癌组织中高表达，但低表达于相应远端癌旁组织，CD90和CD44分子可能与肝癌的发生有关。

肝肿瘤；干细胞标志物；CD90；CD44

肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，手术是主要的治疗方法，但死亡率仍然较高，主要原因是术后复发或远处转移［1-2］。肿瘤干细胞是癌细胞自我更新和分化能力的子集，肝癌干细胞是具有自我更新能力并能产生异质性肿瘤细胞，与肝癌发生、发展、转移等生物学行为相关的一类细胞总称。目前多项研究认为，肝癌侵袭转移和高复发率与肝癌干细胞有关，而常见的肝癌干细胞标志物有CD44、OV6、CD90、CD133、EpCAM、CK19和AFP等［3-5］。本课题组前期对肝癌干细胞标志物CD90和CD44在化学诱发小鼠肝癌模型中的表达及对有关信号通路的调控进行研究［6-7］，发现CD90和CD44分子在小鼠肝癌的发生和发展中有一定作用，为进一步研究其在人肝癌中的影响，本研究通过实时荧光定量PCR和免疫组化技术分别检测CD90和CD44分子在人肝癌组织中的表达，以期进一步阐明两者对肝癌发生发展的影响。

1 材料与方法

1.1 一般资料

收集2014年1月至2014年12月广西医科大学附属肿瘤医院肝胆外科手术切除的40例肝组织标本，术后经病理学检查确诊为肝癌，均属中低分化，无远处转移，术前未行任何相关治疗。同时收集相应远端癌旁组织（距癌组织边缘5 cm）40例，将组织标本快速放入液氮冷冻，置于－80℃冰箱备用。其中男性24例，女性16例；年龄36～68岁，平均年龄（55±0.52）岁。本研究经本院伦理委员会通过，所有患者知情同意。

1.2 试剂与仪器

总RNA提取试剂Trizol购自美国Invitrogen有限公司，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒购自加拿大MBI Fermentas有限公司，FastStart Universal SYBR Green Master购自天根生物科技（北京）有限公司。抗－CD44和抗－CD90均为多克隆兔抗体，稀释液浓度为1∶200，均购自武汉博士德生物有限公司。

1.3 实时荧光定量PCR法检测CD90和CD44基因mRNA的表达

将少量肝组织放入1m L Trizol，电动研磨器冰上研磨，提取总RNA。取2μL RNA，分光光度计检测RNA浓度；1%琼脂糖制作凝胶，电压110 V 15 min电泳，根据电泳结果分析提出的总RNA质量情况；稀释至工作液浓度（50 ng/μL），置于－80℃冰箱保存。

实验步骤根据北京天根生物科技有限公司提供的操作过程进行，每个样本均做3个平行试验。组织RNA经逆转录60℃5min，42℃60min，70℃5min，获得的模板cDNA加至PCR反应体系。CD90上游引物：5'-ACACATACCGCTCCCGAACCAAC-3'，下游引物：5'-GGGCCCCACCAGTCACAGG-3'，预计产物长度为282 bp；CD44上游引物：5'-ATTCCCCGGATCC ACCCCAACT-3'，下游引物：5'-GCCGCTGCTCACGTC ATCATCA-3'，预计产物长度为282 bp；内参基因β-actin上游引物：5'-TGACGTGG ACATCCGCAAAG-3'，下游引物：5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'，预计产物长度为388 bp。反应条件：95℃预变性10 min，95℃变性15 s，60℃退火1 min，共45个循环，每个循环结束时自动荧光定量仪读取荧光信号。所有循环结束后，电脑自动分析并将读取的荧光信号转换成Ct值，得到目的基因及相应内参基因的Ct值，以2-△△Ct分析目的基因相对表达量。

1.4 免疫组化法检测CD90和CD44蛋白表达

1.4.1 肝癌组织固定、包埋与切片用40 g/L甲醛将组织固定，石蜡包埋，2μm厚切片。取1片组织切片行常规HE染色，用于病理诊断；另外2片组织切片行免疫组化实验，检测组织中CD90和CD44表面标志物的表达情况。

1.4.2 组织标本脱蜡及水化将组织切片置于60℃恒温烘箱孵育3 h，依次放入3个二甲苯缸中，每次10min；将已脱蜡的切片依次放入浓度为100%、95%、80%、75%的乙醇中脱二甲苯，每次5 min；切片在蒸馏水中浸10min，用0.01mmol/L PBS缓冲液洗3次，每次2min。

1.4.3 抗原修复及封闭将0.01 M枸橼酸钠缓冲溶液（pH 6.0，工作液）约2 000 mL倒入高压锅加热至沸腾，将切片放入锅内，待高压锅缓慢喷气3min后，室温冷却6 min，取出切片，蒸馏水冲洗，PBS漂洗3次，每次2min。取出切片，每张切片滴加1～2滴3%过氧化氢，室温孵育10min，0.01mmol/L PBS缓冲液洗3次，每次2min。

1.4.4 滴加抗体和封片将稀释浓度为1∶200的一抗CD90、CD44兔多克隆抗体分别滴加在两张封闭切片上，置于湿盒内，4℃过夜。取出切片，室温下复温20min，0.01mmol/L PBS缓冲液振洗3次，每次2min；室温孵育20min，0.01mmol/L PBS缓冲液振洗3次，每次2min；滴加二抗，室温孵育20 min，0.01 mmol/L PBS缓冲液振洗3次，每次2min；滴加DAB显色剂，水冲洗3min，苏木素复染5min，返蓝，脱水，封片。

显微镜下，每张切片随机选择5个高倍视野（×100），每个视野选择100个细胞，计算阳性细胞率并评分：阳性细胞率为0计为0分，阳性细胞率≤25%计为1分，25%＜阳性细胞率≤50%计为2分，50%＜阳性细胞率≤75%计为3分，阳性细胞率＞75%计为4分。进一步按照多数阳性细胞染色强度进行评分：无显色计为0分，浅棕黄色计为1分，棕黄色计为2分，棕褐色计为3分。将上述2项评分相加进行总评分：0分为阴性（－），2～3分为弱阳性（+），4～5分为中度阳性（++），6～7分为强阳性（+++）［8］。

1.5 统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件对数据进行处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两两比较采用配对t检验；计数资料采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝癌组织中CD90和CD44基因mRNA的表达

实时荧光定量PCR检测结果显示，40例肝癌组织中CD90和CD44基因mRNA的表达显著高于远端癌旁组织（P＜0.05），见表1。

表1 CD90和CD44基因m RNA在肝癌组织及远端癌旁组织中的表达（±s）

表1 CD90和CD44基因m RNA在肝癌组织及远端癌旁组织中的表达（±s）

与远端癌旁组织比较，*P＜0.05

达t 3.337 3.572 P 0.005 0.003

2.2 肝癌组织中CD90与CD44蛋白的表达

在光学显微镜下观察肝癌组织和远端癌旁组织HE染色，可见癌组织排列紊乱，癌细胞形态多样，核大深染，分叶；远端癌旁组织异型核细胞少，细胞排列较癌组织整齐（图1）。观察肝癌组织中CD90与CD44表达及定位，发现两种肝癌干细胞标志物均定位于细胞质和（或）细胞膜。CD90主要表达于细胞膜，亦在细胞浆中表达（图2）；CD44主要表达于细胞浆，其次是细胞膜，其阳性细胞呈分散或簇状分布在肝癌组织中（图3）。CD90阳性细胞在肝癌组织和远端癌旁组织中的表达率分别为82.5%（33/40）和17.5%（7/40），CD44阳性细胞分别为77.5%（31/40）和12.5%（5/40），差异均有统计学意义（P＜0.05），见表2、表3。

图1 肝癌组织及远端癌旁组织HE染色（HE染色，×100）

图2 肝癌组织及远端癌旁组织CD90的表达

图3 肝癌组织及远端癌旁组织CD44的表达

表2 肝癌组织及远端癌旁组织中CD90阳性表达的比较（n）

表3 肝癌组织及远端癌旁组织中CD44阳性表达的比较（n）

3 讨论

干细胞是指没有特定功能的不成熟细胞，具有多向分化且不断进行自我更新的能力，一般存在于人骨髓中，也可存在于肿瘤组织。随着对干细胞研究的发展，有学者提出了肿瘤干细胞假设，肿瘤干细胞可能源于某些具有干细胞特性的肿瘤细胞或者突变的正常干细胞［9-11］。存在于肝癌组织中的干细胞称作肝癌干细胞。目前，关于肝癌干细胞的研究已成为生物医学领域的热门学科之一，肝癌的发生、发展及治疗亦是我国科学工作者亟需攻克的一大科学难题。研究表明，CD90在肝癌组织中的表达明显上升，且与肝癌的生物学行为密切相关［12］。CD44阳性细胞具有不断自我复制的特性，这一特性与干细胞相似。有研究证实，CD44可能参与细胞运动，促使肿瘤发生、发展和转移，与肿瘤患者的预后密切相关［13］。

CD90是肝癌干细胞的重要标志物［14］。它主要参与细胞与细胞、细胞与细胞外基质及细胞与细胞质的相互作用，可能与炎症、纤维化及细胞的增殖、凋亡和转移有关。CD44是广泛分布于各类细胞表面的跨膜糖蛋白，属于细胞黏附因子家族的一类。相关研究证实CD44阳性细胞具有肿瘤干细胞的特性，同时具有更强的致瘤能力和更容易转移的特点［15-16］。本研究通过实时荧光定量PCR和免疫组化法分析40例肝癌组织及其相应远端癌旁组织中CD90和CD44的表达，结果显示CD90和CD44在肝癌组织中的表达量高于远端癌旁组织，与Gomes等［17］的研究相似。有研究证实，随着肝癌干细胞发展，肝癌组织中CD90和CD44的表达量高于远端癌旁组织［6，18］。因此推测CD90和CD44可能通过影响肝癌细胞增殖、凋亡、转移和影响细胞表面的跨膜蛋白而参与肝癌的发生发展过程，其相关机制还需进一步探讨。

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［2016-12-21收稿］［2017-02-10修回］［编辑罗惠予］

Expression of CD90 and CD44 in human hepatoma tissues

Zhou Silian，Kuang Zhipeng（Department of Research，Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，P.R.China）Corresponding author：Kuang Zhipeng.E-mail：kgzhou@163.com

Liver neoplasms；Stem cellmarkers；CD90；CD44

R735.7

A

1674-5671（2017）03-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2017.03.05

广西肿瘤学优势特色重点学科资助项目（024012002）

匡志鹏。E-mail：kgzhou＠163．com

【Abstract】Objective To investigate differences in CD90 and CD44 expression between human hepatoma and distal liver.M ethod Expression of CD90 and CD44 wasmeasured using quantitative real-time PCR in human hepatoma and distal liver tissue，and the expression of both proteins was detected by immunohistochemistry.Results Expression of CD90 and CD44 mRNA was significantly higher in human hepatoma than in distal liver（P<0.05）.CD90 and CD44 proteins localized to themembrane and cytoplasm of cancer cells.In human hepatoma，the CD90-positive rate was 82.5%（33/40）and the CD44-positive rate was 77.5%（31/40）；the corresponding values in distal liver tissue were significantly lower：17.5%（7/40）and 12.5%（5/40）（P<0.05）.Conclusion Human liver cancer tissue shows high expression of CD90 and CD44，while distal liver tissue shows low expression.CD90 and CD44 may correlate significantly with the incidence and development of liver cancer.