Survivin、NF-κB、VEGFR-2在食管小细胞癌中的表达及其与甲磺酸阿帕替尼疗效的相关性

成之福孟令新丁兆军孟芹王传艳张桂芳厉兵城

作者单位：276826日照山东省日照市人民医院1药剂科2肿瘤科

临床研究

Survivin、NF-κB、VEGFR-2在食管小细胞癌中的表达及其与甲磺酸阿帕替尼疗效的相关性

成之福1孟令新2丁兆军2孟芹2王传艳2张桂芳2厉兵城2

作者单位：276826日照山东省日照市人民医院1药剂科2肿瘤科

目的探讨食管小细胞癌Survivin、NF-κB和血管内皮细胞生长因子受体2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR-2）的表达及其与甲磺酸阿帕替尼疗效的相关性。方法采用免疫组化SABC法检测36例食管小细胞癌Survivin、NF-κB、VEGFR-2的表达，并计数微血管密度（microvascular density，MVD）和微淋巴管密度（micro-lymphatic vessel density，MLVD），分析各指标与MVD、MLVD计数及甲磺酸阿帕替尼疗效的关系。结果Survivin、NF-κB和VEGFR-2在食管小细胞癌中的阳性表达率分别为22.22%、66.67%和80.56%。Survivin、MLVD与食管小细胞癌淋巴结转移和浸润深度均无相关性（P＞0.05）。VEGFR-2、NF-κB表达及MVD与淋巴结转移密切相关（P＜0.05），与浸润深度无关（P＞0.05）。NF-κB、VEGFR-2表达阳性者MVD明显高于阴性表达者（P＜0.05）。NF-κB、VEGFR-2阳性组患者口服甲磺酸阿帕替尼治疗的疗效优于阴性组，而Survivin阳性、阴性组疗效差异无统计学意义（P＞0.05）。结论食管小细胞癌中的VEGFR-2、NF-κB表达及MVD均与淋巴结转移密切相关，NF-κB、VEGFR-2阳性表达可作为口服甲磺酸阿帕替尼靶向治疗的生物学参考靶标。

食管肿瘤；Survivin；NF-κB；VEGFR-2；微血管密度；微淋巴管密度；甲磺酸阿帕替尼

食管小细胞癌临床少见，发生率占同期食管癌的0.8%～9.0%，恶性程度高，预后差。目前尚无理想治疗手段，国内外多采用手术切除、局部放疗及全身化疗等综合治疗。甲磺酸阿帕替尼是全球第一个治疗晚期胃癌被证实安全有效的小分子抗血管生成靶向药物，也是晚期胃癌标准化疗失败后，可明显延长生存期的单药［1］，2014年12月13日获国家食品药品监管局批准上市。但其治疗食管小细胞癌效果如何，目前国内外尚无循证医学证据。存活素（Survivin）是1997年发现的凋亡抑制蛋白家族的新成员，在人类绝大多数肿瘤中均表达，在调节肿瘤血管生成方面发挥重要作用［2-4］。NF-κB作为核转录因子具有多向性转录调节作用，可诱导抗凋亡基因表达上调，在食管癌组织中高表达，且促进食管癌进展，患者总生存期较短，预后不良［5］。血管内皮细胞生长因子受体2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR-2）可促进内皮细胞增殖与淋巴结转移，是食管癌独立预后因素之一［6-7］。本研究采用免疫组化SABC法对食管小细胞癌中Survivin、NF-κB、VEGFR-2、微血管密度（microvascular density，MVD）及微淋巴管密度（microly-lymphatic vessel density，MLVD）进行检测，分析各指标与甲磺酸阿帕替尼疗效的相关性，以期为食管小细胞癌靶向治疗提供依据及可靠的分子靶标。

1 材料和方法

1.1 一般资料

收集2014年10月至2015年12月我院收治的经病理学检查确诊的原发性食管小细胞癌36例，其中男性22例，女性14例，年龄39～76岁，平均年龄（49.3±10.3）岁。所有患者均为术后进展期且放化疗效果不佳的广泛期患者。根据患者术后病理检查结果，按局部淋巴结转移情况分为有淋巴结转移和无淋巴结转移两组；根据肿瘤浸润深度，分为浸润至肌层以内（Ⅰ+Ⅱ）和浸润至外膜及外膜以外（Ⅲ+Ⅳ）两组。口服甲磺酸阿帕替尼靶向治疗经医院医学伦理委员会批准，患者知情同意。

1.2 药物治疗

甲磺酸阿帕替尼片（商品名：艾坦）为江苏恒瑞医药股份有限公司生产，批准文号：国药准字H20140105。425 mg口服，每天一次，每4周进行疗效评价。评价内容包括临床症状、体征、胸部CT、上消化道钡餐透视、肿瘤标志物NSE表达水平等。

1.3 试剂与方法

兔抗人Survivin多克隆抗体、兔抗人NF-κB多克隆抗体、兔抗人VEGFR-2多克隆抗体、鼠抗人CD34单克隆抗体购自北京中杉生物工程技术有限公司。食管小细胞癌术后标本均经10%福尔马林液固定，5μm厚连续切片。采用免疫组化SABC法。主要步骤：石蜡标本切片，二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，0.3% H2O2阻断内源性过氧化物酶，DNA显色。Survivin组柠檬酸缓冲液高温修复，VEGFR-2、NF-κB加EDTA抗原修复液高温修复。用PBS代替一抗作阴性对照。

1.4 判断标准

Survivin、NF-κB、VEGFR-2阳性物质主要定位于细胞质，呈棕黄色颗粒状。高倍镜下（×400）随机选择10个视野，每个视野计算阳性细胞百分比，以整张切片中阳性细胞数≥5%判为阳性，<5%为阴性。MVD判断参照Weidner等［8］报道方法，先在低倍镜下（×100）观察肿瘤内血管密度最高处，以肿瘤区域内染成棕褐色单个内皮细胞或内皮细胞丛作为一个微血管计算，管腔小于5～7个红细胞大小予以计数，然后在高倍镜下（×200）随机计5个视野的微血管数，取平均值。MLVD选择肿瘤中心区域，方法同MVD。疗效判定按照RECIST 1.1实体瘤客观疗效评定标准［9］，治疗4周后评价，每隔4周重新评价。分为⑴完全缓解（CR）：所有目标病灶消失并维持4周；⑵部分缓解（PR）：基线病灶最大径之和缩小≥30%并维持4周；⑶疾病进展（PD）：基线病灶最大径之和增加≥20%或出现新病灶；⑷疾病稳定（SD）：基线病灶最大径之和缩小但未达PR，或者增加但未达PD。以CR+PR计算总有效率（RR）。疾病控制率（DCR）＝（CR+PR+SD）/总例数×100%，无进展生存期（PFS）为入组至肿瘤进展或死亡的时间。总生存期（OS）为入组至因任何原因引起死亡的时间。

1.5 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件包对数据进行处理，阳性率比较采用Fisher精确概率法，MVD、MLVD分析采用非参数检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 疗效及安全性

本组患者平均用药时间为31周（6～53周）。RR为27.8%（10/36），DCR为75.0%（27/36），PFS为8.6个月，OS为19个月。常见的毒副反应为血压升高、胃肠道反应和血液毒性。血压升高一般为轻-中度（1～2级），1例患者出现高血压3级，常规降压药物可控制。胃肠道反应（恶心、反酸、腹泻）和手足综合征（手掌、足底红肿疼痛或指端红斑）通常为轻-中度（1～2级）。见表1。

表1 甲磺酸阿帕替尼治疗食管小细胞癌患者的毒副反应（n）

2.2 Survivin、NF-κB、VEGFR-2表达与临床病理特征的关系

在36例食管小细胞癌中，Survivin、NF-κB和VEGFR-2阳性表达率分别为22.22%（8/36）、66.67%（24/36）和80.56%（29/36）。其中Survivin表达与患者年龄、性别、浸润深度、淋巴结转移无关（P＞0.05），NF-κB、VEGFR-2表达与淋巴结转移相关（P＜0.05），而与患者年龄、性别和浸润深度均无关（P＞0.05），见表2。Survivin、NF-κB、VEGFR-2在食管小细胞癌中阳性表达情况见图1。

2.3 MVD和MLVD与临床病理特征的关系

食管小细胞癌MVD与淋巴结转移有关（P＜0.05），与性别、年龄、浸润深度均无关（P＞0.05）。肿瘤中心区域MLVD与性别、年龄、淋巴结转移、浸润深度均无关（P＞0.05），见表3。

图1 Survivin、NF-κB、VEGFR-2在食管小细胞癌中的表达（SABC法，×400）

表2 Survivin、NF-κB、VEGFR-2表达与临床病理特征的关系［n（%）］

表3 MVD、M LVD与临床病理特征的关系（±s）

表3 MVD、M LVD与临床病理特征的关系（±s）

临床病理特征n MVD P MLVD P年龄（岁）0.514 0.671＜60 25 35.00±16.23 4.80±4.97≥60 11 34.00±14.64 5.56±6.85性别0.463 0.548男22 36.00±11.98 4.50±6.87女14 41.00±12.05 5.30±6.42浸润深度0.496 0.718Ⅰ+Ⅱ21 34.00±16.22 5.00±9.22Ⅲ+Ⅳ15 43.65±14.98 4.50±8.73淋巴结转移0.005 0.647有24 45.00±16.75 4.00±7.86无12 25.00±7.08 5.00±9.64

2.4 Survivin、VEGFR-2、NF-κB表达与MVD、MLVD的关系

MVD在NF-κB、VEGFR-2阳性患者中的表达明显高于阴性患者（P<0.05），而MVD在Survivin阳性、阴性患者中的表达差异无统计学意义（P>0.05）。MLVD在Survivin、VEGFR-2、NF-κB阳性、阴性患者中的表达差异亦无统计学意义（P>0.05），见表4。

表4 Survivin、VEGFR-2、NF-κB表达与MVD、MLVD的关系（±s）

表4 Survivin、VEGFR-2、NF-κB表达与MVD、MLVD的关系（±s）

组别n MVD P MLVD P Survivin 0.297 0.205 + 8 39.35±17.46 3.00±7.65 -28 35.60±16.25 5.00±8.64 NF-κB 0.035 0.472 + 24 38.50±16.46 4.00±9.44 -12 28.60±11.12 5.00±8.42 VEGFR-2 0.042 0.346 + 29 43.00±16.06 4.50±8.57 -7 27.50±5.22 5.00±10.04

2.5 Survivin、VEGFR-2、NF-κB表达与甲磺酸阿帕替尼疗效的关系

NF-κB和VEGFR-2表达阳性者有效率分别为33.33%（8/24）和31.03%（9/29），明显高于阴性表达者的16.67%（2/12）和16.67%（1/6），差异有统计学意义（P<0.05）。而Survivin阳性、阴性表达者疗效差异无统计学意义（25.00%vs 28.57%，P＝0.435）。

3 讨论

食管小细胞癌是除小细胞肺癌外最常见的一种小细胞癌，具有恶性程度高、生长快、易发生广泛转移的特点［10］，临床治疗效果不佳，经血道和淋巴结转移是食管小细胞癌患者预后较差的重要原因。

肿瘤MVD和MLVD是目前采用最多的检测肿瘤血管、淋巴管生成的指标。Kawamura等［11］发现肿瘤中央区域淋巴管数量少、处于无功能状态的原因，可能与不断分化增殖的肿瘤细胞产生的机械压力和持续较高的肿瘤内压力使瘤内淋巴管发生塌陷、萎缩或淋巴管网络被入侵的肿瘤细胞破坏有关。Wang等［12］研究发现，胃癌周围区MLVD与淋巴管侵犯和淋巴结转移密切相关，与浸润深度无关；而肿瘤中心区域MLVD与浸润深度、淋巴结侵犯和淋巴结转移均无关。本研究结果显示，食管小细胞癌中MVD与淋巴结转移有关，与浸润深度无关，肿瘤中心区域MLVD与淋巴结转移、浸润深度均无关，进一步验证了肿瘤中心区域的MLVD可能是非功能性的。

Survivin基因是迄今为止发现的最强的凋亡抑制基因，起初认为其主要通过直接抑制caspase级联反应下游的终末子caspase-9的活性发挥抗凋亡作用。近来发现，Survivin基因还参与有丝分裂纺锤体检查点的监管、促进血管生成和化疗药物的耐药性，通过复杂的调控网络机制激发启动子活性、p53基因功能的缺失、去甲基化改变等，从而抑制肿瘤细胞凋亡、促进肿瘤细胞增殖分化和肿瘤血管生成，提示其可能是一种新的检测恶性肿瘤的指标［13］。笔者发现在Survivin与肿瘤临床病理学特征的关系方面，文献报道不一致。有学者报道食管鳞癌中Survivin与分化程度、淋巴结转移和浸润深度均无明显相关性，而在伴有核着色的患者中Survivin蛋白表达与浸润深度和淋巴结转移有关［14］。本研究所检测的细胞质染色的Survivin与淋巴结转移和浸润深度均无关，Survivin阳性组MVD、MLVD与阴性组差异亦无统计学意义，提示Survivin主要在细胞核而不是在细胞质中发挥作用，可通过核定位影响肿瘤浸润和转移。

NF-κB作为一种多向功能的转录因子，在许多疾病中发挥重要作用，常以异源二聚体形式存在于体内多种细胞中。近年发现，NF-κB在多种肿瘤中高表达并可诱导某些抗凋亡基因表达上调，抑制细胞凋亡。Paccez等［15］证实食管鳞癌细胞系中存在激活的NF-κB通路，且活化的NF-κB对食管鳞癌细胞生存和增殖有重要作用。本研究结果显示NF-κB与食管小细胞癌淋巴结转移密切相关，发生淋巴结转移的食管小细胞癌组织中NF-κB阳性表达率为79.17%，显著高于无淋巴结转移的41.67%。但NF-κB与浸润深度无明显相关性（P>0.05）。此外，NF-κB阳性组的MVD显著高于阴性组，但两组瘤内MLVD差异无统计学意义，表明NF-κB参与食管小细胞癌发展，在促进血管形成和淋巴结转移方面有重要作用，可能通过调节与血管新生有关的VEGF和IL-8表达，诱导产生肿瘤血管，促使肿瘤转移。但是否促进淋巴管形成，是否与食管小细胞癌瘤体边缘区域MLVD相关，有待进一步研究。已有研究提示一些药物可通过干预NF-κB发挥效应，抑制恶性肿瘤发展，可用于食管小细胞癌治疗［16］。

VEGF作为血小板源性生长因子家族成员之一，是肿瘤血管生成过程中最重要的血管内皮生长刺激因子。吴英娟等［17］发现VEGF-C蛋白和mRNA在胃腺癌组织中均高表达，VEGF-C蛋白和基因水平的阳性表达率分别为64%和73%，且基因水平表达明显高于癌旁正常组织，提示VEGF-C可能介导淋巴管内皮细胞趋化性和淋巴管增生、参与癌细胞迁移到局部淋巴结。但VEGFR-2在食管小细胞癌中的研究未见报道。本研究结果显示，发生淋巴结转移的食管小细胞癌中VEGFR-2阳性表达率明显高于未发生淋巴结转移者，VEGFR-2阳性组的MVD也显著高于阴性组。但在食管小细胞癌VEGFR-2阳性、阴性表达组织中，肿瘤中心区域MLVD计数差异无统计学意义，表明VEGFR-2可能通过诱导食管小细胞癌周围区域淋巴管而非中心区域淋巴管形成促进淋巴结转移，具体机制尚待深入研究。

在临床疗效观察中发现食管小细胞癌VEGFR-2、NF-κB阳性表达者口服甲磺酸阿帕替尼疗效明显，VEGFR-2阳性表达者尤为明显，提示VEGFR-2、NF-κB阳性表达与甲磺酸阿帕替尼具有相关性。但Survivin表达与甲磺酸阿帕替尼疗效无明显相关性，提示VEGFR-2、NF-κB阳性表达有望作为食管小细胞癌口服甲磺酸阿帕替尼靶向治疗的分子靶标。有研究［18-19］发现对于二线及以上的VEGFR-2阳性表达的晚期胃癌、食管胃结合部腺癌患者，口服阿帕替尼可明显延长患者的PFS和OS。本研究结果发现在食管小细胞癌中VEGFR-2阳性表达者获益明显。免疫组织化学和免疫印迹方法发现染色体区域维护1（CRM1）在食管鳞癌中高表达，CRM1高表达患者生存期较短，预后较差；CRM1基因沉默可引起鳞癌细胞系凋亡，NF-κB在食管鳞癌发生发展、浸润转移过程中受CRM1基因影响［20］。本研究36例食管小细胞癌NF-κB阳性表达率为66.67%，且NF-κB表达阳性者有效率明显高于阴性表达者，提示NF-κB可作为甲磺酸阿帕替尼靶向治疗疗效评估的潜在分子靶标。同时发现口服甲磺酸阿帕替尼与肿瘤化疗药物严重毒副反应和易产生耐药性相比，具有口服方便、毒副反应少等优点，但由于本研究病例数较少，且缺少VEGFR-2、NF-κB表达的多因素亚组分析，有关方面值得深入研究。

总之，深入研究微血管和微淋巴管形成相关因子在食管小细胞癌中的表达，了解其作用机制，在癌变早期进行MVD检测，对于研究采取针对性的干预措施，以促进肿瘤细胞凋亡、降低肿瘤血管新生具有重要作用［21］。检测VEGFR-2、NF-κB的表达作为食管小细胞癌甲磺酸阿帕替尼靶向治疗靶标的作用有待深入探讨。

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［2017-02-15收稿］［2017-04-25修回］［编辑江德吉］

Expression of Survivin，NF-κB and VEGFR-2 and their relationship w ith Apatinib therapy in small-cell carcinoma of esophagus

Cheng Zhifu1，Meng Lingxin2，Ding Zhaojun2，Meng Qin2，Wang Chuanyan2，Zhang Guifang2，LiBingcheng2（1Department of Pharmacy，2Department of Oncology，Rizhao People Hospital，Rizhao 276826，P.R.China）

Meng Lingxin.E-mail:menglx001623@163.com

Objective To investigate the expression of Survivin，NF-κB，and VEGFR-2 as well as their relationships with treatment effects of Apatinib and with microvascular density and micro-lymphatic vessel density in small-cell carcinoma of esophagus.M ethods Immunohistochemistry was used to assess expression of Survivin，NF-κB and VEGFR-2 as well as microvascular density and micro-lymphatic vessel density in 36 casesof small-cell carcinoma of the esophagus.The resultswere compared with Apatinib treatment efficacy.Results Rates of positive expression were 22.22%for Survivin，66.67%for NF-κB and 80.56%for VEGFR-2.Lymphatic metastasis did not correlate with expression of Survivin，micro-lymphatic vessel density or tumor invasion depth.Lymphatic metastasis did correlate with expression of VEGFR-2，NF-κB and microvascular density，but notwith tumor invasion depth.Microvascular density was higher in samples positive for NF-κB expression than in negative samples.Treatment effects of Apatinib were better in patients positive for NF-κB and VEGFR-2 expression than in expression-negative patients；treatment effects，however，did not vary with Survivinexpression status.Conclusion Tumor lymphatic metastasis correlated significantly with VEGFR-2，NF-κB and microvascular density. NF-κB and VEGFR-2may play an important role in small-cell carcinoma and may be useful biomarkers in Apatinib therapy.

Esophageal neoplasms；Survivin;NF-κB；VEGFR-2；Microvascular density；Micro-lymphatic vessel density；Apatinib

R735.1

A

1674-5671（2017）03-06

10.3969/j.issn.1674-5671.2017.03.06

山东省医药卫生科技发展计划资助项目（2016WS0329）；济宁医学院青年教师科研扶持基金资助项目（JY2016K J050Y）

孟令新。E-mail：menglx001623@163.com