UPLC指纹图谱结合模式识别分析不同产地生/制何首乌

肖榕+林艳+雷思敏+章莹+黄杰+夏伯候+李春+廖端芳+吴萍+林丽美

[摘要] 采用超高效液相色谱（UPLC），建立不同产地生/制何首乌二苯乙烯苷（TSG）的含量测定方法和指纹图谱。大孔树脂柱处理各样品，UPLC分析，Waters ACQUITY UPLC@BEH C₁₈色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），乙腈-0.5%甲酸溶液梯度洗脱，流速0.3 mL·min^-1，波长254 nm，柱温（25±5） ℃。结果发现大孔树脂分离后药材二苯乙烯苷含量均在25.0%以上；成功建立不同产地生/制何首乌药材UPLC指纹图谱；标定了17个色谱峰，聚类分析不能完全将生/制首乌分开，而主成分分析可明显地将其分为两类；二苯乙烯苷是两类何首乌自变量投影重要性指标（VIP）差异最大的组分。前处理方法可获得高含量的二苯乙烯苷，测定方法简单，灵敏，可靠，可用于生/制何首乌的快速鉴别，可作为何首乌药材整体质量控制的方法之一。

[关键词] 何首乌； 二苯乙烯苷； UPLC指纹图谱； 聚类分析； 主成分分析

[Abstract] To establish a content determination method for 2，3，5，4′-tetrahydroxy stilbene-2-O-β-D-glucoside （TSG） of the crude/processed root of Polygonum multiflorum from different habitats in China and set up the fingerprint by using UPLC. Various samples were pretreated by macro-porous resin. Then UPLC analysis was performed on Waters ACQUITY UPLC@BEH C₁₈ chromatographic column （2.1 mm×50 mm，1.7 μm） at （25±5） ℃. A binary gradient elution system was composed of acetonitrile （phase A） and 0.5% acetic acid solution （phase B）. Detection was performed at the wavelength of 254 nm， and the mobile flow rate was set at 0.3 mL·min^-1. Results showed that the yield of extraction of the 2，3，5，4′-tetrahydroxy stilbene-2-O-β-D-glucoside from root of P. multiflorum was all over 25.0% after macro-porous resin separation； an exclusive UPLC fingerprint method of the crude/processed root of P. multiflorum from different habitats was successfully set up and 17 chromatographic peaks were calibrated. Cluster analysis can not entirely distinguish the crude one from the processed one， while principal component analysis absolutely can. 2，3，5，4′-tetrahydroxy stilbene-2-O-β-D-glucoside is the composition that has largest differences in variable importance in projection （VIP） between crude and processed root of P. multiflorum. The separating method can gain high-purity 2，3，5，4′-tetrahydroxy stilbene-2-O-β-D-glucoside， and the determination method is simple， sensitive， reliable and can be used in fast identifying the crude/processed root of P. multiflorum or as a method for overall quality control of root of P. multiflorum.

[Key words] Polygonum multiflorum； 2，3，5，4′-tetrahydroxy stilbene-2-O-β-D-glucoside； UPLC fingerprint； cluster analysis； principal components analysis

何首烏为蓼科植物何首乌Polygonum multiflorum Thunb.的干燥块根[1]，具有保护神经、抗衰老、降血脂、抗动脉粥样硬化和促进生长等多方面的药理作用[2]，主要活性成分包含蒽醌类、二苯乙烯苷类、黄酮类、磷脂类等[3]。其中2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（简称二苯乙烯苷，TSG）是何首乌最具代表性的特征性成分，有降低胆固醇，增强免疫，抗骨质疏松，调节脂质，抗动脉粥样硬化等功效[4]，现已被2015年版《中国药典》采纳作为何首乌质量控制的指标性成分[5]。传统上，何首乌有生首乌和制首乌之分。生首乌是取原药材，除去杂质，洗净，润透，切块，干燥后所得；制首乌是生首乌经不同炮制方法而成[2]。所以不同产地、是否炮制均影响何首乌TSG含量、化学成分及功效[6]。

目前，指纹图谱结合模式识别方法已被应用于药物的质量控制、差异标记物的筛选等方面[7-8]。因此，本文采用UPLC建立何首乌指纹图谱，并通过相似度分析、聚类分析、主成分分析等模式识别方法比较不同产地何首乌中TSG的含量，评价生/制何首乌指纹图谱，寻找其主要的差异成分，为何首乌药材的质量控制标准提供新的参考方法。

1 材料

Waters Acquity UPLC 超高效液相色谱仪，Empower 工作站，含四元梯度泵、自动进样器（美国Waters公司）；RE-52AA型旋转蒸发仪（上海雅荣生化设备仪器有限公司）；KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；CP114型电子分析天平[奥豪斯仪器（上海）有限公司，1/1万]、101型电热鼓风干燥箱（北京市永光明医疗器械厂）；电热恒温水浴锅（北京国华医疗器械厂）；0.22 μm微孔滤膜（上海安谱实验科技股份有限公司）。

二苯乙烯苷为实验室自制获得，通过NMR和MS鉴定其结构，采用面积归一化法通过UPLC檢测其纯度大于98%；甲醇，乙腈（色谱纯，Honeywell 公司）；甲酸（色谱纯，天津市化学试剂研究所），水为双蒸水，其余试剂均为分析纯。

何首乌药材由作者收集，经湖南中医药大学生药学教研室龚力民副教授鉴定为何首乌的P. multiflorum的干燥块根，其中S1～S9为生首乌，S10～S16为制首乌，具体见表1。

2 方法

2.1 样品的前处理

何首乌药材粉末，每份称取20 g，共计48份。用8，6，6倍的70%乙醇回流提取3次，每次2 h，合并提取液，减压浓缩回收乙醇水溶液至40 mL。浓缩液通过大孔树脂分离，分别采用蒸馏水，50%，75%，95%乙醇溶液洗脱药材，收集50%乙醇洗脱液，浓缩、冷冻干燥得固体，备用。

2.2 色谱条件

色谱柱为Waters ACQUITY UPLC@BEH-C₁₈（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），流速0.3 mL·min^-1，检测波长254 nm，柱温（25±5） ℃，进样量2 μL，流动相乙腈（A）-0.5%甲酸（C），梯度洗脱（0～3 min，10%～15%A；3～8 min，15%～20%A；8～11 min，20%～30%A；11～14 min，30%～50%A；14～19 mim，50%～68%A；19～24 min，68%～69%A；24～25 min，69%～100%A）。

2.3 对照品溶液的制备

取二苯乙烯苷对照品适量，精密称定为12.68 mg，置25 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制得对照品储备液。取一定量对照品储备液用甲醇逐次稀释，得到质量浓度分别为50.72，101.44，202.88，304.32，405.76，507.20 mg·L^-1的对照品溶液。

2.4 供试品溶液的制备

分别将不同产地何首乌样品，取50%乙醇洗脱部位的何首乌各样品粉末约2.0 mg，精密称定，置10 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，0.22 μm滤膜滤过，UPLC分析。

2.5 线性关系考察

以对照品浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），二苯乙烯苷的回归方程为Y=2×10⁶X-81 541，r=0.999 5，在0.101 4～1.014 μg内线性关系良好。

2.6 精密度试验

取何首乌样品，按供试品溶液的制备方法制备，用2.2项下条件连续进样6次，记录指纹图谱。以二苯乙烯苷为参照峰，计算共有峰的相对保留时间及相对峰面积，利用《中药指纹图谱相似度评价系统软件》（2012版），进行相似度评价[9]。结果各共有峰相对保留时间RSD<0.61%，相对峰面积RSD<2.7%，表明仪器精密度良好。

2.7 重复性试验

取何首乌样品，按供试品溶液的制备方法平行制备供试品溶液6份，用2.2项下色谱条件进样，记录指纹图谱。以二苯乙烯苷为参照峰，计算共有峰的相对保留时间及相对峰面积，利用《中药指纹图谱相似度评价系统软件》（2012版），进行相似度评价。结果各共有峰相对保留时间RSD<0.61%，相对峰面积RSD均<2.2%，表明重复性良好。

2.8 稳定性试验

取何首乌样品，按供试品溶液的制备方法制备，用2.2项下色谱条件进样，分别于0，1，2，4，6，8，12 h依法进行UPLC测定并记录色谱峰。以二苯乙烯苷为参照峰，计算共有峰的相对保留时间及相对峰面积，利用《中药指纹图谱相似度评价系统软件》（2012版），进行相似度评价。结果各共有峰相对保留时间RSD<0.62%，相对峰面积RSD均<2.6%，表明12 h内供试品溶液的成分是稳定的。

3 结果

3.1 含量测定

UPLC测定得到不同产地何首乌样品色谱图，并计算各样品中二苯乙烯苷的含量。所有批次样品二苯乙烯苷的含量都达到25.0%以上，说明此样品前处理方法分离效果良好，结果见表2。

3.2 指纹图谱建立及相似度评价

3.2.1 参照峰的选择 二苯乙烯苷作为何首乌中的主要成分，在每个批次中分离度都良好且峰面积较大，因此选择二苯乙烯苷（4号峰）作为参照峰，将各色谱保留时间与同一图谱中参照物的保留时间比较，其比值为各色谱峰的相对保留时间，相对保留时间在规定值的±3.0%以内。

3.2.2 共有峰的确定 根据16批生、制何首乌药材UPLC分析，发现17个共有峰，构建何首乌UPLC色谱图特征指纹图谱，以此作为何首乌鉴别的依据。

3.2.3 相似度计算及对照指纹图谱的生成 经试验测定得到16批不同产地生、制何首乌指纹图谱，见图1，将16批样品指纹图谱的CDF数据文件导入中药指纹图谱相似度评价系统（2012版），进行相似度计算，设置样品S5图谱为参照图谱，对照图谱生成方法采用平均数法，时间窗宽度为0.3，自动匹配，生成对照指纹图谱，见图2，其相似度结果见表3。

3.2.4 何首乌指纹图谱相似度评价 与16批何首乌所生成的对照指纹图谱比较，各批次的何首乌样品相似度在0.904～0.997，表明各批次何首乌质量相对稳定；由图1，2可知各产地何首乌内在成分与对照指纹图谱基本相似，则表明各化学成分基本一致，但各峰的峰面积有所差异，表明各成分的量有所不同；从表3可以看出，样品S1，S2，S8相似度相对较低，其余各样品相似度较高，其中S8相似度最低。

3.3 不同产地何首乌药材指纹图谱聚类分析

以不同产地生、制何首乌样品的共有峰峰面积为变量，采用SPSS 22.0统计软件进行聚类分析，结果见图3。采用离差平方和（ward）法选取欧式距离平方和作为样本测度。结果显示，当欧式距离平方和为15时，何首乌药材可以分为2类，Ⅰ类S11，S14，S15，S16，S10，S12，S2，S13；Ⅱ类S6，S7，S4，S5，S9，S1，S3，S8。基本分为生、制2类，只有S2被归类成Ⅰ类，可能是由于其中二苯乙烯苷的含量稍较低所导致。

3.4 主成分分析（PCA）

为了合理评价、综合分析何首乌的品质，将何首乌共有峰峰面积进行主成分分析，将16批何首乌样品的共有峰面积导入SIMCA 13.0中，得到3大特征主成分PC1，PC2，PC3，结果见图4。从所得的方差贡献率来看，建立的模型累计解释能力参数R2Y、预测能力参数Q2分别为0.923，0.746，说明该模型的区分程度和预测程度都较好，所以对前3个主成分分析已基本能反映出何首乌的主要特征。

以主成分建立坐标系，得到16批样品的PCA得分图和三维得分图，见图5，6，表明生、制何首乌之间有一定的区分，说明炮制后的何首乌与何首乌生药在化学成分的量上具有一定的差异性。根据PLS-DA模型的VIP值来筛选导致差异性的主要化学成分，结果见图7。一般认为VIP>1的变量对分类起着关键作用，从图7可知：4号峰、9号峰、3号峰的VIP均大于1，且4号峰的VIP值为3.2937，因此导致生、制何首乌最大差异的是4号峰（二苯乙烯苷）。根据PCA得分图可以看出样品S1～S9为一类，S10～S16为一类。从三维得分图可以看出：不同产地制首乌经炮制后都聚集在一起，差异不大；生何首乌除样品S8外其他样品基本聚集在一起。

4 讨论

本试验对样品的提取方法，分离条件进行考察，最终前处理方法采用大孔树脂进行分离纯化，研究表明大孔树脂具有吸附量大，易再生，可反复使用等特点[10]，经过本课题组前期研究发现此方法能得到较高含量和纯度的二苯乙烯苷，是纯化二苯乙烯苷的最佳工艺方法。

本试验选用了甲醇-0.1%甲酸，乙腈-0.1%甲酸，乙腈-0.5%甲酸作为流动相，对检测波长254，280，320 nm进行了优选。最终确定采用Waters ACQUITY UPLC@BEH-C₁₈（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）柱，乙腈-0.5%甲酸为流动相，254 nm为检测波长[11-12]。得到UPLC特征指纹图谱色谱峰较多，分离效果较好，此方法简便，用时短，稳定可靠，重复性好。

对16批样品建立不同产地生/制何首乌指纹图谱，共确认17个共有峰，从所得图谱可知各批次药材的共有峰保留时间差异较小，但峰面积却有一定差异，表明不同批次生/制何首乌之间部分化学成分的量有所不同。但根据其相似度可以看出，16批药材的相似度计算结果均大于0.900，说明各批次药材质量相对稳定，有较好的一致性。聚类分析除S2样品外，基本将生、制何首乌区分开来。结合二苯乙烯苷的含量测定结果，可能是由于S2的二苯乙烯苷含量低于其他各产地生何首乌的量，同时PLS-DA模型的VIP值表明对此成分贡献最大峰为二苯乙烯苷，因此导致将S2分至制何首乌一类。但从主成分分析结果来看，完全将生/制何首乌区分开来；同时样品S8较偏离生何首乌这组其他样品，这与16批样品的相似度结果基本一致，进一步验证了所建指纹图谱的可靠性与准确性。

运用UPLC指纹图谱结合模式识别对不同产地生/制何首乌药材质量进行评价，此识别模式能对不同产地生/制何首乌进行多指标，整体性分析，此结论较之单一的测定更为全面准确，且建立的方法简便，可靠，可用于何首乌药材质量评价和控制。

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[责任编辑 孔晶晶]