铁皮石斛产业化关键科学与技术的突破

斯金平+王琦+刘仲健+刘京晶+罗毅波

[摘要] 针对铁皮石斛繁殖难、种植难、产品单一等产业发展重大问题，通过铁皮石斛基因组学研究，明确铁皮石斛为二倍体、有38条染色体、28 910个蛋白编码基因及在转录组水平上的器官基因表达特异性，具有大量种子而种子没有胚乳、广泛生态适应性、多糖合成的基因调控机制，为铁皮石斛遗传工程育种和活性药用成分的开发利用提供了理论基础；攻克了结实难、发芽难等繁育难题，建立了组培快繁体系，实现种苗工厂化生产，奠定了铁皮石斛人工种植基础；建立了铁皮石斛育种体系，明确了重要经济性状的遗传变异规律，育成铁皮石斛系列专用品种（品系），解决了实生后代分离严重问题，支撑铁皮石斛产业升级；揭示了目标化合物动态变化规律、养分吸收机制，突破了栽培基质、光调控、精准采收等关键技术，建立了设施栽培、活树附生、岩壁附生、立体栽培、盆栽等系列栽培模式，实现种出铁皮石斛、种出好的铁皮石斛。

[关键词] 铁皮石斛； 基因组学； 品种选育； 种苗繁育； 栽培模式

[Abstract] In view of the significant difficulties of propagation， planting and simple product in Dendrobium catenatum（D. officinale）industry development， a series of research were carried out. Genome study showed that D. catenatum is a specie of diploid with 38 chromosomes and 28 910 protein-coding genes. It was identified that specific genes accumulated in different organs at the transcriptome level. We got an insight into the gene regulation mechanism of the loss of the endospermous seed， the wide ecological adaptability and the synthesis of polysaccharides， which provided a theoretical basis for genetic engineering breeding and development and utilization of active pharmaceutical ingredients. The rapid propagation system was established for applying to industrialized production by overcoming breeding problems on seed setting and sprouting， which laid a foundation for artificial cultivation of D. catenatum. And in order to give a clear explanation of genetic variation of important economic traits， we built up the breeding system. Since special varieties of D. catenatum were bred， it helped solve the problem of trait segregation of seedling progeny and support the improvement of D. catenatum industry. The regulation of dynamic variation of target compounds， together with the mechanism of nutrient uptake， was revealed. The breakthrough of key technologies including culture substrates， light regulation and precisely collection was carried out. Several cultivation modes like facility cultivation， original ecological cultivation， cliff epiphytic cultivation， stereoscopic cultivation and potting cultivation were set up. Above all， the goal of cultivating D. catenatum as well as producing good D. catenatum will be achieved.

[Key words] Dendrobium catenatum （D. officinale）； genome； variety improvement； breeding； cultivation modes

鐵皮石斛Dendrobium catenatum（D. officinale）[1]，始载于《神农本草经》，历代本草均有记载，具有益胃生津、滋阴清热、增强免疫力、抗肿瘤等独特功效 [2]。因繁殖与种植等重大难题，长期以来主要利用野生资源，导致资源枯竭而列为国家保护中药材，并制约产业发展[3]。20世纪90年代以来，逐一解决了铁皮石斛产业化的关键科学技术问题，形成系列原创性成果，使铁皮石斛产业从无到有，并形成百亿级产业。为了促进成果转化，本文以作者研究为基础就该领域相关研究进行总结。

1 铁皮石斛基因组学取得突破 为铁皮石斛深入的分子和功能研究提供了基础

铁皮石斛全基因组测序研究结果表明[4]，铁皮石斛为二倍体，有38条染色体，及28 910个蛋白编码基因。研究发现，铁皮石斛与蝴蝶兰一起分享了在K/T线附近发生的兰科植物全基因复制事件而躲过了大灭绝。铁皮石斛与蝴蝶兰拥有几乎相同基因数量，但是铁皮石斛由于TPS，R和HSP等基因家族大量扩张，使铁皮石斛具有极强应对逆境的能力和防止病原物侵害的免疫能力，可在高温、寒冷、高湿或干旱的环境中生长，形成了能在树上和岩石上附生的特性而分布于温带、亚热带甚至热带的广大地区，从而揭示了其广泛的生态适应性的基因调控机制；发现涉及铁皮石斛多糖代谢通路及其多糖合成环节中关键基因的扩增现象，揭示了铁皮石斛产生大量多糖和茎干变得肥大的分子机制，为人工合成药用多糖提供分子基础；发现铁皮石斛MADS-box基因家族中参与植物生长发育调控的基因家族ANR1，StMADS11，MIKC* 3个分支出现扩张，从而揭示石斛属植物形态具有高度多样性的分子调控机制，而MADS-box Ⅰ类基因家族成员发生了丢失，致使铁皮石斛具有许多种子而种子没有胚乳是铁皮石斛自然繁殖困难的主要原因。研究团队还开展了铁皮石斛遗传多样性及抗寒基因、多糖合成酶基因的筛选[5-12]。

Meng Yijun等[13]结合RNA，sRNA和降解组测序进行了铁皮石斛转录组水平上的器官基因表达特异性研究，从铁皮石斛的花、根、叶和茎4个器官的RNA测序结果中得到536 558个转录本组装序列，其中有2 645，256，42，54个转录本分别在花、根、叶和茎4个器官中高表达。基于sRNA测序，发现有2 038，2，21，24个sRNA分别在花、根、叶和茎特异性富集。同时，在sRNA测序过程中还检测到1 047个成熟的候选miRNA。基于对二级结构的预测和测序，从测序转录本中鉴定到数十个潜在miRNA前体。有趣的是，有2条sRNA前体中的长茎结构发现与不同阶段的降解组处理结果相关联。对1 047个候选miRNA开展靶基因识别，结果发现1 257个配对组合。在此基础上，建立了一些包括激素信号转导、发育、次生代谢和Argonaute1蛋白调控相关的生物学子网络，研究结果为铁皮石斛进行深入的分子和功能研究提供了宝贵资源。

针对铁皮石斛主要活性成分多糖，Zhang等[14]通过转录组测序与分析，构建了铁皮石斛幼年和成年植株的了2个cDNA文库Dendrobium-1和Dendrobium-2，确定了铁皮石斛中果糖和甘露糖的代谢途径及参与其中的135个基因，筛选鉴定了430个糖基转移酶、89个纤维素合成酶基因和627个参与铁皮石斛次生代谢的转录因子，其中37个差异表达的纤维素合成酶基因在铁皮石斛的甘露聚糖合成中起着重要作用。研究成果丰富了铁皮石斛转录组信息，并为分离鉴定参与多糖生物合成的候选基因及阐明多糖生物合成机制提供有价值的参考。

2 攻克铁皮石斛种苗繁育难题 实现种苗低碳生产

研究发现了铁皮石斛自交不育、花粉黏性低与高活力期短、花结构特殊等自然结果率低的主要原因；在开花后第25天人工控制授粉，结实率达到82.6%，10月下旬至11月初果实成熟，每个蒴果有效种子达5 000粒以上[15]。

通过基本培养基（MS，KC，N6，B5，SH）、植物生长调节物质（细胞分裂素、生长素）、天然附加物（马铃薯、香蕉、苹果）、微量元素、pH等关键因素综合调控，筛选出1/2MS培养基为种子萌发、原球茎分化和试管苗生根的基础培养基，MS与改良MS培养基为原球茎增殖和壮苗培养的基础培养基；6-BA 0.5～1.0 mg·L^-1+NAA 1.0 mg·L^-1+KT 1.0 mg·L^-1等植物生长调节物质的组合有效原球茎增殖倍数为11.7；6-BA 2.0～3.0 mg·L^-1+NAA 0.5～1.0 mg·L^-1+KT 1.0 mg·L^-1组合原球茎芽分化率达90%以上。种子、茎段、叶片、根尖等外植体均建立了组培快繁体系，并实现产业化生产[16-18]。

通过光强、光周期、光质的研究，发现14 h光照（光照強度10～30 μmol·m^-2·s^-1）、10 h暗培养交替是种子萌发的理想条件，16 h光照（光照强度30～50 μmol·m^-2·s^-1）、8 h暗培养交替是原球茎分化与生根壮苗培养条件；白光有利于丛芽萌发，红蓝混光有利于幼苗生长。综合利用优化的培养基与日光灯、自然光结合的组培专用光源系统，有效地解决了铁皮石斛发芽难、幼苗生长慢、能耗大等问题，铁皮石斛从种子到生根成苗仅需150～180 d，种苗培育期缩短30～60 d，能耗降低70%，空间利用率提高30%[17-20]。

3 建立铁皮石斛育种体系 实现栽培品种化

因历代本草都强调产地的作用，《神农本草经》记载“药有……土地所出，真伪陈新”；孙思邈《千金翼方》中强调“药出州土”，直至20世纪90年，我国药用植物育种工作仍处于起步阶段。国际上，药用植物育种起步也很晚，1996年在德国召开了第一次药用和芳香植物育种研究国际会议。通过全面分析铁皮石斛种质、入药部位、生长年限、采收季节、外观形态与标志性成分的关系，揭示其有效成分的时空变异规律，明确传统产区的药材质量差异并非完全由当地的气候、土壤等环境因素作用于植物当代，而是这种环境因素已使药材群体产生遗传分化，形成了有遗传差异的地理种源，种质（品种）类型决定了药材的质量。基于铁皮石斛分布广、遗传多样性丰富，药材安全性要求高的特点，提出了“全分布区种质资源搜集—农艺性状、功效成分、功能基因系统评价—种内杂交与分子辅助育种结合—选育专用化品种（无性系、家系）”的铁皮石斛品种选育新方法[21]。

收集了全国主产区铁皮石斛种质资源305份，完成遗传多样性分析，子代多糖、甘露糖等主要活性成分定量测定，植株高度、粗度、萌蘖能力、抗寒性、抗病虫害能力等农艺性状的差异性检测与评价，分子标记遗传多态性达到95.3%[22]，多糖量变幅22.6%～57.0%，浸出物量3.5%～26.2%，耐低温-14.8～0 ℃；在育种亲本差异检测与筛选的基础上，选择互补性强的亲本进行种内杂交，创制出新种质360份，建立了多样的铁皮石斛种质资源库。

品种专用化包括用途（功效）的专用化，用法的专用化，栽培条件的专用化。如用于加工提高免疫功能的冲剂的铁皮石斛要求提高免疫功能强、高产，对外观的要求没有必要；用于加工枫斗的不仅要求优质、高产，还要求茎的粗细适中；用于鲜食的除了质量、产量因素外，还要求化渣性好、口感好；用于原生态栽培的，必须具有很好的适应环境能力，如抗低温与高温能力、干旱与水湿能力、病害与虫害能力、高光效与高肥效特点。根据铁皮石斛生物特性，基于绿色生产、品种专用化、种内杂交与分子标记辅助育种结合的品种选育新方法和有性制种无性扩繁的策略，解决了实生后代表型与功效成分含量性状分离严重问题[21]，经子代测定[23-25]选育出质量、产量、抗逆能力、农艺性状等方面特异性明显、遗传稳定、一致性好的“森山1号”、“晶品1号”2个品种和“晶品966”、“晶品6A2B”、“晶品天目山”等优良品系，其中“森山1号”系国内首批符合《中国药典》质量要求的铁皮石斛品种，多糖量达32.11%；“晶品1号”系国内首个通过种内杂交选育的铁皮石斛良种，多糖、浸出物量分别达到46.1%，11.3%，超过2015年版《中国药典》的84.4%，73.8%，增产61.3%，适合野外生态栽培，2015年特大寒潮中，浙江义乌以南海拔300 m以下区域-9 ℃均能正常越冬；“晶品天目山”品系经历了2015年寒潮（-14.8 ℃），生长仍然正常，为近野生栽培提供了保障。

4 突破铁皮石斛栽培关键技术 建立系列栽培模式

通过基质、光照、水分、通气、温度等关键因素与铁皮石斛生长发育关系的研究，筛选出铁皮石斛栽培最佳基质——松树皮，从种植难成活提高到成活率98.0%，实现种出铁皮石斛[17-18]；揭示了铁皮石斛多糖、浸出物等功效成分的时空变异规律，其中多糖含量及其组成与开花密切相關，开花显著消耗铁皮石斛药材中的多糖及其甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖的量，而开花过程可能有利于木糖、阿拉伯糖的积累；醇溶性浸出物含量与新芽形成、萌动密切相关，新芽萌动醇溶性浸出物迅速下降。根据铁皮石斛多糖与醇溶性浸出物含量、产量的动态变化规律，提出精准采收技术：改种植后4年全草采收为萌条二年生3月底至开花前采收，生命周期产量提高1倍，多糖含量提高30%[26-30]。对铁皮石斛氨基酸，总生物碱，以及钾、钙、镁、锰、锌、铬、铜、砷、汞、铅、镉等金属元素分析表明，均与种质与采收时机密切相关[31-34]。从铁皮石斛分离鉴定出2 816个菌株，归属3门7纲22目43科57属，初步研究表明，内生真菌与铁皮石斛生长与品质形成密切相关，其中DO14菌株与铁皮石斛种苗共培养，提高生长量5.6%，总多糖量113.7%，甘露糖42.2%，并从其代谢产物中分离到具有抗肿瘤和抗真菌活性的2个新化合物[35-36]。

通过铁皮石斛营养特性、种植季节、光照与水分调控等关键技术研究，在栽培技术创新的基础上，建立了设施栽培模式[37]，遮阳率70%、松树皮为基质、3—5月或9—10月种植、3～5株丛栽、2.5万丛/亩（1亩≈667 m2），生长季节每天喷水1～2 h；活树附生栽培模式[37-38]，以自然生长的树木作为载体，50%左右郁闭度、3—5月栽培、露根捆绑1～1.5年生种苗、每天喷水1 h、软体动物防治，栽培过程不施肥料、不用农药；岩壁栽培模式[39-40]，以垂直崖壁为载体，栽培过程不施肥料、不用农药，并使铁皮石斛回归自然，种植成本更低、药材质量更优，其中一年生悬崖栽培铁皮石斛多糖与醇溶性浸出物含量分别高于设施基质栽培9.2%，2.6%，二年生分别高6.7%，5.3%；立体种植模式[41]，以人工立柱或立木为载体的土地利用率提高2～3倍，基质利用率提高30%，单位面积产量提高50%以上；集成铁皮石斛栽培关键技术，制定了国家行业标准《铁皮石斛栽培技术规程》。

5 产业升级研发重点

5.1 利用铁皮石斛基因组学开展铁皮石斛遗传工程育种和活性药用成分的开发利用 我国铁皮石斛产业近年来快速发展，形成了庞大的产业链，年产值高达130多亿元，但在产业发展过程中存在种源混杂、伪劣产品充斥市场、产品功效机制不清等制约铁皮石斛产业的健康和持续发展问题。因此，充分利用铁皮石斛全基因组图谱，挖掘铁皮石斛重要功能基因，开展铁皮石斛分子标记辅助育种；利用铁皮石斛多糖与小分子化合物的基因调控机制，开发治疗糖尿病及其并发症、抗忧郁症、抗衰老、提高记忆力和治疗阿尔茨海默氏病等新药；利用物种适应性机制，研究如何提高人体免疫力的机理，开发保健产品；利用铁皮石斛特异基因，开展物种保护和品质鉴定，对产业转型升级具有重要价值。

5.2 从剂型多样化向功效多样化转变 铁皮石斛产品已经实现冲剂、胶囊、片剂、浸膏、口服液、饮料等等多种剂型，但开发的功效主要是“增强免疫力”“抗疲劳”，而且机制不清，其他有助于降低血脂、降低血糖、改善睡眠、抗氧化、缓解体力疲劳、清咽、降低酒精性肝损伤危害等功效远未得到开发。研究团队初步发现，铁皮石斛内含有的多糖成分在治疗糖尿病方面，能起到维持胰岛素平衡，对糖尿病、肝纤维化等具有明显效果；其含有的小分子化合物对于老年痴呆症具有显著治疗效果，拥有延长寿命的功能，开发潜力巨大。

5.3 铁皮石斛栽培技术转型升级 目前90%以上的药材来源于设施基质栽培，存在土地资源制约，投入大，药材功效不如野生等问题；以软体动物为主的铁皮石斛病虫害，每年成灾面积占栽培面积的50%以上，绝收10%以上，年损失数亿元；占铁皮石斛生物量50%以上的叶、花，有较好的功效，但既不能当食品、也不能当药材，存在严重浪费。因此，研究铁皮石斛近野生栽培技术，包括森林生态对近野生栽培铁皮石斛产量与品质的影响规律，明确栽培环境、内生真菌、养分来源与吸收机制；研究铁皮石斛软体动物综合防控技术，调查铁皮石斛主要有害生物，揭示其发生规律，提出综合防控技术；研究铁皮石斛资源综合利用，包括开展铁皮石斛叶和花功效与安全性评价，开发以铁皮石斛叶或花为原料的新资源食品，提高铁皮石斛综合利用率，对铁皮石斛产业转型升级至关重要。

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[责任编辑 吕冬梅]