半滑舌鳎溃疡病原杀鲑气单胞菌的分离鉴定与药敏试验

周红霞，姚俊杰，房文红，李新苍，赵 姝，王 元，吴俣学，周俊芳

（1.贵州大学动物科学学院水产科学系，贵阳 550025；2.中国水产科学研究院东海水产研究所，农业部东海与远洋渔业资源开发利用重点实验室，上海 200090）

半滑舌鳎溃疡病原杀鲑气单胞菌的
分离鉴定与药敏试验

周红霞1，姚俊杰1，房文红2，李新苍2，赵 姝2，王 元2，吴俣学1，周俊芳2

（1.贵州大学动物科学学院水产科学系，贵阳 550025；2.中国水产科学研究院东海水产研究所，农业部东海与远洋渔业资源开发利用重点实验室，上海 200090）

半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis Günther）是广受我国消费者认可的名优鱼类，具有很高的营养价值和经济价值，然而，随着工厂化养殖模式的不断发展，疾病成为制约半滑舌鳎养殖业健康发展的关键因素，其中，体表溃疡病为其常见病症。从严重溃疡病半滑舌鳎体内分离到1株优势菌株HX0416，该菌可在TCBS培养基上生长，并可在绵羊血平板上形成清晰的β-溶血环；经过16S rRNA和rpoD基因序列同源性分析并结合生化特性鉴定为杀鲑气单胞菌（Aeromonas salmonicida）。健康半滑舌鳎幼鱼感染试验表明，该菌对半滑舌鳎具有较强致病性，感染72 h（1.04×106cfu·mL-1）对攻毒鱼的致死率达91.7%。药敏试验结果显示，该菌对环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星等喹诺酮类和头孢曲松、头孢吡肟等头孢菌素类药物比较敏感，而对硫酸新霉素、土霉素等氨基糖苷类和四环素类药物多重耐药，尤其是对磺胺甲噁唑、氨苄西林等磺胺类和β-内酰胺类药物严重耐药。

半滑舌鳎；杀鲑气单胞菌；溃疡病；生化特征；药敏试验

半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis Günther）属鲽形目（Pleuronectiformes），舌鳎科（Cynoglossidae），舌鳎属，主要分布于我国黄渤海海域。半滑舌鳎生长速度快，营养丰富，味道鲜美，具很高的营养价值和经济价值，是倍受消费者推崇的名优品种，养殖规模不断扩大。然而，随着工厂化、集约化养殖模式的不断推进，半滑舌鳎病害问题日趋严重，临床常见体表溃疡病、烂尾病、腹水症和肠炎病等［1-4］，对半滑舌鳎养殖业造成重大经济损失。

到目前为止，研究人员已经对半滑舌鳎相关疾病进行了广泛的探究，但是，由于半滑舌鳎疾病命名的依据主要是临床表现，而且在养殖生产中常常呈现两种以上临床症状并存等原因［1］，导致其病原认定存在一定分歧，仅导致半滑舌鳎“溃疡病”的病原就有多种报道：徐晓丽等［5］从溃疡病半滑舌鳎体表病灶、肝脏和肾脏分离得到2株优势菌株，经16S rDNA序列分析鉴定为牙鲆肠弧菌（Vibrio ichthyoenteri）和哈维弧菌（V.harveyi）；陈政强等［6-7］从患有严重溃疡病的半滑舌鳎病灶中分离出4种优势菌，人工感染后确认其中哈维弧菌和轮虫弧菌（V.rotiferianus）均为溃疡病病原；除了弧菌外，还有报道认为半滑舌鳎溃疡病与美人鱼发光杆菌杀鱼亚种（Photobacterium damselae subsp.piscicida）［2］和鳗利斯顿菌（Listonella anguillarum）［3］的感染密切相关。本研究从严重溃疡病半滑舌鳎病灶深处分离到1株优势菌株HX0416，人工感染表明其可导致健康半滑舌鳎幼鱼死亡。随后，本研究利用分子生物学和生化特征鉴定方法对该分离菌株进行了种属鉴定，并对其药物敏感性进行了检测，以期为半滑舌蹋溃疡病的防治提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

江苏某工厂化养殖（流水养殖模式）的半滑舌鳎发生严重的皮肤溃疡病，本研究采集部分濒死半滑舌鳎，充氧空运到实验室；健康半滑舌鳎幼鱼（≈48.13 g）购自山东半滑舌鳎养殖户，充氧空运到实验室。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离与纯化

用75%的酒精棉对濒死半滑舌鳎体表消毒后，从病鱼的初期溃疡点深处截取少量溃烂肌肉，用无菌盐水冲洗并剪碎，划线接种于2216E海水细菌培养基（海博），28℃恒温箱培养24 h，挑取形态特征一致的优势菌落再次划线分离，获得纯培养菌株，命名为HX0416。同时，把纯化后的菌株接种于TCBS平板（海博）和含5%绵羊血营养琼脂平板上，28℃恒温箱培养24 h，观察菌落颜色及形态特征。

1.2.2 分子鉴定及系统发育分析

挑取少量纯化菌株HX0416，参照细菌基因组DNA提取试剂盒（天根）说明书提取细菌基因组DNA，作为PCR模板，分别用下列引物扩增分离菌株的16S rRNA和rpoD基因片段。16S rRNA的引物为：正向27F：5′-AGAGTTTGATC（C／A）TGGCTCAG-3′和反向1492R：5′-TACGG（C／T）TACCTTGTTACGACTT-3′［8］，扩增条件为：95℃预变性5 min；然后94℃变性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸2 min，循环30次；最后72℃延伸10min；rpoD基因的引物为：正向rpoD 70Fs：5′-ACGACTGACCCGGTACGCATGTA-3′和反向rpoD 70Rs：5′-ATAGAAATAACCAGACGTAAGT T-3′［9］，扩增条件为：95℃预变性5 min；然后95℃变性30 s，47℃退火30 s，72℃延伸1 min 20 s，循环30次；最后72℃延伸5min。PCR产物直接送上海生物工程有限公司测序，所得序列经BLAST比对分析序列同源性；同时，下载GenBank中相似性较高的菌株16S rRNA序列以及已经报道的鲆鲽类溃疡病相关病原的16S rRNA序列，采用MEGA 7.0软件包中的Neighbor-Joining法构建系统发育树，并通过自举分析进行置信度检测，自举数据集为1 000次。

1.2.3 生理生化特征

对纯化菌株HX0416进行革兰氏染色，确定菌的形态特性。然后，参照法国生物梅里埃公司API 20NE试剂条说明书对菌株进行生化鉴定，参考鱼类细菌性病原生化特征［10］进一步确定分离菌株的特征；同时，利用梅里埃ATB自动细菌鉴定仪和相应的细菌鉴定卡对其各项理化指标进行分析。

1.2.4 药敏试验

采用文献［11-13］描述的微量肉汤稀释法测定分离菌株HX0416对16种常用抗菌药物（表3）的敏感性。以大肠杆菌ATCC25922作为质控菌株，并设置阳性（无抗生素菌液）和阴性（MH肉汤）对照，将无菌生长的最低药物浓度视为最小抑菌浓度（MIC）。

1.2.5 健康舌鳎感染实验

将上述鉴定的纯化菌株HX0416接种于含盐TSB肉汤（TSB+1.5%NaCl）培养，28℃培养24 h后，取1 mL菌液用PBS（0.1 mol·L-1，pH 7.4）作10倍梯度稀释，得到不同浓度的稀释菌液（100～109）。根据分离菌生长状况和预实验结果，取3个较高稀释度（107～109）的菌液涂布2216E平板培养，50μL／板，采用平板计数法计数；同时，另取3个较低稀释度（104～106）的菌液腹腔注射，每个梯度攻毒12 ind，注射量为100μL ·ind-1，对照组注射等量PBS（0.1 mol·L-1，pH 7.4）。试验组和对照组分别暂养于玻纤桶中（6 ind／桶，2桶／组，桶容积300 L，水量200 L），水温控制在（21±1）℃。正常投喂颗粒饲料，保持充氧和正常换水，观察并记录半滑舌鳎的发病和死亡情况，持续观察7 d。

2 结果与分析

2.1 临床症状

患溃疡病半滑舌鳎体表、头部呈现不同大小、溃烂程度不一的溃疡灶，体表粘液增多，严重发病鱼创面大且溃烂出血，病鱼濒死（图1）；背鳍不同程度溃烂，部分鱼还有烂尾现象。该病常年都有发生，2～3月发病最为严重；不同养殖池和不同时期养殖鱼的发病率和死亡率差异较大，严重池发病率达90%，死亡率60%。

图1 患溃疡病半滑舌鳎Fig.1 A C.sem ilaevis Günther suffering from severe skin ulceration disease

2.2 分离菌特点

溃疡组织初次在2216E上培养出生长快速、表面光滑、轻微隆起、湿润、圆形的乳白色优势菌落。纯化菌株可以在TCBS培养基生长，菌落为黄色，直径约0.2 cm；在绵羊血平板上出现清晰的β-溶血环。革兰氏染色鉴定为G-短杆菌，命名为菌株HX0416。

2.3 16SrRNA和rpoD基因鉴定

PCR扩增HX0416分离株16S rRNA基因后得到1466bp左右的产物。利用BLAST程序，对测得产物的序列在GenBank中进行同源序列搜索，结果显示，该分离菌与多种气单胞菌的同源性均在99%以上，在16S rRNA系统发育树中与不同种气单胞菌聚为一簇（图2），归在同一分支，而与美人鱼发光杆菌杀鱼亚种、哈维弧菌、鳗利斯顿菌以及轮虫弧菌等亲缘关系较远，分属不同分支，可见，分离菌株HX0416为气单胞菌属细菌，但是，仅凭16S rRNA结果不能鉴定到种。

PCR扩增气单胞菌HX0416菌株rpoD基因后得到860bp左右的产物，对应序列提交GenBank后获得序列号为MF071282。经过BLAST分析和构建系统发育树后发现，气单胞菌HX0416与多株杀鲑气单胞菌的同源性均在99%以上，与杀鲑气单胞菌聚为一簇，而与其它种气单胞菌遗传距离较远（图3），因此，气单胞菌HX0416分离株应为杀鲑气单胞菌。

2.4 生化特征分析

利用梅里埃公司API 20NE试剂条和梅里埃ATB自动细菌鉴定仪配套G-细菌鉴定卡获得HX0416菌株的生化鉴定结果，如表1和表2所示。全面分析各项指标，发现该菌与气单胞菌的生化特征相似度最高；而且该菌氧化酶阳性、O／129耐受、β-溶血、吲哚试验阳性、精氨酸双水解酶阳性、发酵葡萄糖产酸产气，发酵蔗糖、麦芽糖、阿拉伯糖，且能水解七叶灵等，根据《细菌性鱼类病原：养殖和野生鱼类疾病》中不同细菌性病原的特征［10］，进一步确认该分离菌株HX0416为气单胞菌属的杀鲑气单胞菌。

图2 16S rRNA基因序列分析聚类结果Fig.2 Cluster results of 16S rRNA gene sequence

图3 气单胞菌rpoD基因序列分析聚类结果Fig.3 Cluster results of rpoD gene of Aeromonas sp.sequence

从表1还可以看到，该菌株只对API 20NE项目中的脲素、癸酸、己二酸、柠檬酸和苯乙酸这5个鉴定项目反应阴性，其它鉴定项目均为阳性，而且具有β-溶血的特点，与杀鲑气单胞菌各个亚种的生化特性比对［10］，结果显示，HX0416菌株与杀鲑气单胞菌杀鲑亚种最为接近。

表1 气单胞菌菌株HX0416的生化特征Tab.1 Biochem ical characteristics of Aeromonas strain HX0416

表2 气单胞菌菌株HX0416的其它生化特性Tab.2 Other biochem ical characteristics of Aeromonas strain HX0416

2.5 药物敏感试验

所试的16种抗生素中，气单胞菌菌株HX0416对环丙沙星、氯霉素、美洛培南、头孢曲松、庆大霉素、头孢吡肟、恩诺沙星和诺氟沙星等8种抗生素敏感，而对硫酸新霉素、利福平、氟苯尼考、土霉素、氨苄西林、磺胺甲噁唑等6种抗生素具有抗性，尤其是对氨苄西林和磺胺甲噁唑耐药严重（表3）。

2.6 健康舌鳎感染试验

平板计数法显示，107稀释度组每板平均菌落数为52个（50μL／板），因此，107稀释度组对应菌液浓度为1.04×103cfu·mL-1，104～106稀释度组对应的菌液浓度为1.04×106～1.04×104cfu·mL-1。气单胞菌菌株HX0416经腹腔注射半滑舌鳎幼鱼36 h后，攻毒鱼开始出现死亡，至72 h时，最高浓度组（1.04×106cfu·mL-1）攻毒鱼的死亡率已经达91.7%（表4）。

表3 气单胞菌菌株HX0416对16种抗菌药物的M IC结果Tab.3 M IC of Aeromonas strain HX0416 to 16 antim icrobial agents

表4 健康半滑舌鳎幼鱼感染菌株HX0416后的死亡率Tab.4 M ortality of C.sem ilaevis Günther infected w ith Aeromonas strain HX0416

3 讨论

气单胞菌是水生革兰氏阴性杆菌，广泛分布于海淡水动物及其环境中，宿主众多。随着水产养殖模式向高度集约化发展之势和养殖环境的日趋恶化，气单胞菌种类及其所致疾病也随之逐渐增多。其中，对养殖动物有重要影响的气单胞菌有嗜水气单胞菌（A.hydrophila）、维氏气单胞菌（A.veronii）和杀鲑气单胞菌等［14-15］，可导致养殖动物肠炎、腹水、溃疡等多种疾病。其中，嗜水气单胞菌还是一种典型的人-兽-鱼共患病原菌，可致患者腹泻或其它病原继发感染［16］，因此，气单胞菌及其所致疾病受到广泛重视。

杀鲑气单胞菌最初从鲑科鱼类［17］分离获得，近年来在鲤科鱼类、鲆鲽类等鱼［15，18-19］中也有相关报道，以导致感染动物体表疥疮、溃疡为主要特征。随着发病动物和分离菌的增多，该种已有杀鲑亚种（salmonicida）、无色亚种（achromogenes）、杀日本鲑亚种（masoucida）、史氏亚种（smithia）和非典型亚种（atypical）共5个［10］，而且，新的亚种［20］还在不断增加中：张晓君等［20］从患细菌性败血症的石鲽（Kareius bicoloratus）体内分离到一株优势菌，通过形态特征、理化特性等表观分类学指征以及16S rRNA系统发育分析，鉴定该分离菌株为杀鲑气单胞菌，但其与杀鲑气单胞菌所有已知亚种在生化特性上差异较大，因此，命名为新的亚种——杀鲽亚种（A.salmonicida subsp.flounderacida subsp.nov）。本研究分离的杀鲑气单胞菌生化特性（API 20NE）与经典杀鲑亚种［10］非常接近，但是，也存在少数生化特征的差异：经典杀鲑亚种不能分解色氨酸（TRP），且不能利用阿拉伯糖（ARA）和甘露糖（MNE），而本研究分离的杀鲑气单胞菌菌株HX0416不仅能分解色氨酸产生吲哚，而且既能利用阿拉伯糖又能利用甘露糖。我们推测，造成这种差异的原因可能是由于生存环境改变、宿主动物种属差异等致使病原自身的某些生物学特性发生了轻微变化。

由于分离菌株的生化特征常常与经典菌株不完全相同［3，5］，因此，随着分子生物学的迅速发展，基因水平的分子生物学鉴定方法被广泛应用于细菌种属的鉴定中。由于细菌16S rRNA基因序列在系统发育过程中高度保守而最先被广泛用于细菌的种属鉴定，但是，在应用过程中越来越多的研究发现，16S rRNA基因序列在某些细菌属内高度保守，以致不能有效鉴别细菌的不同种或亚种［6，20］，因此，目前分离菌株的鉴定常常采用生化特征分析与基因鉴定相结合的方法，相互印证［3，5-6，21］。本研究结合16S rRNA、rpoD基因系统发育分析以及气单胞菌及其种和亚种的生化特征、菌落特点等经典分类学指征，最终将分离菌株HX0416鉴定为杀鲑气单胞菌，并与杀鲑亚种最为接近。从该菌的16S rRNA系统发育分析中，我们发现，菌株HX0416与前期报道的半滑舌鳎溃疡相关病原菌——美人鱼发光杆菌杀鱼亚种、哈维弧菌、鳗利斯顿菌以及轮虫弧菌等不在同一个大的分支，亲缘关系较远。造成这种溃疡病相关病原种类较多的原因，我们认为主要有以下两种：1）不同养殖环境以及不同抗菌药物的使用可能导致不同养殖场出现不同的优势菌种，这些不同的菌种有可能导致同样的溃疡症状，而半滑舌鳎疾病命名的依据主要是其临床症状（如溃疡病），因此，同为“溃疡病”却有多种病原菌。2）半滑舌鳎养殖生产中常常存在两种以上临床症状并存的情况，比如有些溃疡病也存在腹水的症状［5-7］，有些腹水病也存在烂尾的情况［3］等，细菌或其它病原的并发与继发可能导致了优势病原种属的差异。因此，除了建议尽可能从病原角度进行疾病命名外［22］，本研究认为这些研究并不矛盾，这些病原对半滑舌鳎的健康养殖均具有重要影响，均为半滑舌鳎养殖过程中需要重点关注的病原。

本研究对分离菌株HX0416的药敏试验显示，虽然该杀鲑气单胞菌对喹诺酮类和头孢菌素类的多种药物比较敏感，但是对氨基糖苷类、四环素类药物多重耐受，尤其是对β-内酰胺类和磺胺类药物严重耐受，胡梦华等［23］在研究海水副溶血弧菌时也发现了类似耐药现象。这些结果既说明同为海水来源菌可能携带了类似的耐药基因／质粒［24-26］，但也可能像YI等［27］指出的那样，我们在养殖生产中药物使用的频繁与偏好导致了耐药的累积与传播。总之，本研究结果表明，在半滑舌鳎养殖过程中存在多种病原感染、致病的情况，在疾病防治过程中要加强综合管理，注重用药的针对性和科学性，避免多种病原并发或继发感染，严防耐药菌的产生与传播。

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Isolation and identification＆antim icrobial susceptibility test of Aeromonas salmonicida associated w ith the skin ulceration disease of Cynoglossus sem ilaevis Günther

ZHOU Hong-xia1，YAO Jun-jie1，FANGWen-hong2，LIXin-cang2，ZHAO Shu2，WANG Yuan2，WU Yu-xue1，ZHOU Jun-fang2
（1.Department of Fisheries Science，College of Animal Science，Guizhou University，Guiyang 550025，China；2.East China sea Fisheries Research Institute，CAFS，Key Laboratory of East China Sea and Oceanic Fishery Resources Exploitation and Utilization，Ministry of Agriculture，Shanghai 200090，China）

Cynoglossus semilaevis Günther is known as a famous fish in China for its high nutritional and economic value.However，with the continuous development of factory farmingmodel，diseases have become the key factor to restrict the healthy development of Cynoglossus semilaevis Günther aquaculture，and skin ulceration disease was themost common one.In this study，one dominant strain HX0416 was isolated from Cynoglossus semilaevis Günther with severe skin ulceration disease.The bacterium could grow well on the TCBS agar and form the obvious beta hemolytic ring on the sheep blood agar.Analysis of16S rRNA and rpoD gene sequence combined with biochemical characteristics demonstrated that the isolate HX0416 was Aeromonas salmonicida.Animal infection experiment showed that the strain was pathogenic to Cynoglossus semilaevis Günther.When the concentration of bacterium was 1.04×106cfu／mL，about91.7%juvenile fishes died at 72 h after infection.Antimicrobial susceptibility tests indicated that strain HX0416 was sensitive to quinolones and cephalosporins such as ciprofloxacin，enrofloxacin，norfloxacin，ceftriaxone and cefepime，while resistant to aminoglycosides and tetracyclines such as neomycin sulfate and oxytetracycline，and severely resistant to both sulfonamides andβ-lactams such as sulfamethoxazole and ampicillin.

Cynoglossus semilaevis Günther；Aeromonas salmonicida；skin ulceration disease；biochemical characteristics；antimicrobial susceptibility test

Q 93-331

A

1004-2490（2017）03-0322-09

2017-03-19

公益性行业（农业）科研专项（201303047）；国家自然科学基金（31372550）

周红霞（1989-），女，硕士研究生，研究方向为水产动物繁殖与发育生物学。

周俊芳，副研究员。Tel：021-65699301，E-mail：zhoujf＠ecsf.ac.cn