壮药清解雾化液质量标准研究

莫小林，伍小燕 ，龚敏阳，陈晓明，韦振源

（广西中医药大学第一附属医院，广西南宁530023）

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壮药清解雾化液质量标准研究

莫小林，伍小燕 ，龚敏阳，陈晓明，韦振源

（广西中医药大学第一附属医院，广西南宁530023）

目的建立清解雾化液的质量标准。方法采用薄层色谱法（TLC）对清解雾化液中的桑叶、一点红、岗梅根进行定性鉴定。采用高效液相色谱（HPLC）法测定清解雾化液中芦丁的含量，色谱柱为Discovery C18柱（250 mm×4.6 mm，5 m），流动相为甲醇－0.1%磷酸溶液（35∶65），检测波长为356 nm，流速为1.0mL／min，柱温为35℃。结果桑叶、一点红、岗梅根薄层色谱斑点清晰，阴性对照无干扰；芦丁质量浓度在2～20 g／mL范围内与峰面积线性关系良好，r＝0.999 6，平均回收率为99.92%，RSD为0.99%（n＝6）。结论该方法操作简单、专属性和重复性良好，可作为该制剂的质量控制方法。

清解雾化液；质量标准；薄层色谱法；高效液相色谱法；芦丁

壮药清解雾化液为广西中医药大学第一附属医院在研医疗机构制剂，由医院儿科李伟伟主任医师于广西壮乡民间挖掘整理而成。全方由桑叶（壮语名Mbawsang）、千里光（壮语名Gogoujleixmingz）、岗梅根（壮语名Raggodiem jcaengh）、一点红（壮语名Gemh onh）等壮药材组方，具有疏风清热、解毒利咽的功效[1]，用于治疗儿童呼吸道感染性疾病，已有10多年的临床应用经验，并取得了一定的临床疗效，但目前尚无清解雾化液的质量标准。本研究小组欲将其申报为医院制剂，为了确保其质量稳定性和临床有效性，本研究中建立了桑叶、岗梅根、一点红的薄层色谱（TLC）鉴别方法，同时建立了制剂中桑叶有效成分芦丁的含量测定方法。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC－20AT型高效液相色谱仪，包括DGU－20A泵和SPD－20A型紫外检测器(日本岛津公司）；HCT－360型柱温箱（天津市恒科技发展有限公司）；YOKOCS型紫外线透射反射成像仪（武汉药科新技术开发有限公司）；GH－25型电子分析天平（精度为十万分之一，德国Sartorius公司）；KQ3200DE型数控超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；CD－UPT－Ⅱ－10L型超纯水制造系统（成都超纯科技有限公司）；HHW型三用恒温水箱（金坛市大自动仪器厂）；硅胶G（青岛海洋化工有限公司）。

1.2 试药

桑叶对照药材（批号为121123－201305），一点红对照药材（批号为121359－200703）；岗梅根对照药材（批号为121152－201103）；芦丁对照品（批号为100080－201409），以上对照品和对照药材均购自中国食品药品检定研究院；水为超纯水，甲醇和磷酸为色谱纯，其余试剂均为分析纯；清解雾化液样品（批号分别为20140403，20140713，20140726，广西中医药大学第一附属医院制剂室）。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别[2]

2.1.1 桑叶

取本品40 mL，加甲醇50m L，加热回流1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加水20m L，使溶解，加氯仿液30m L振摇，弃去氯仿液，水溶液用水饱和的正丁醇振摇，提取2次，每次20mL，合并正丁醇提取液，正丁醇提取液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取桑叶对照药材2 g，加乙醇30 mL，回流提取2 h，过滤，滤液蒸干，残渣加水30 m L使溶解，用氯仿振摇，提取3次，每次30 m L，合并氯仿液，滤液蒸干，残渣加甲醇1m L使溶解，作为对照药材溶液。再取缺桑叶的阴性样品40 mL，按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。照薄层色谱法2015年版《中国药典（一部)》附录ⅥB试验，吸取上述3种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿－甲醇（13∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯下（365 nm）检视。供试品溶液色谱中，在与桑叶对照药材溶液色谱相应位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰(图1)。

1－3.供试品溶液4.桑叶对照药材溶液5.阴性对照品溶液图1桑叶薄层色谱鉴别图

2.1.2 一点红

取本品20 m L，加入乙醚20m L，超声处理30min，过滤，滤液蒸干，残渣加20 mL水使溶解，用氯仿提取2次，每次20 m L，合并氯仿液，超声处理30 min，过滤，滤液蒸干，残渣加1m L氯仿溶解，作为供试品溶液。称取一点红对照药材5 g，加80%乙醇80mL，回流提取1 h，过滤，滤液蒸干，残渣加20mL水使溶解；加入乙醚20m L，超声处理30min，过滤，滤液蒸干，残渣加20m L水溶解，用氯仿提取2次，每次20 mL，合并氯仿液，超声处理30min，过滤，滤液蒸干，残渣加1m L氯仿溶解，制成对照药材溶液。另取处方中无一点红的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。照薄层色谱法，分别吸取上述3种溶液各5μL，点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯－石油醚－乙酸乙酯（13∶5∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与一点红对照药材溶液色谱相应位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰(图2)。

1－3.供试品溶液4.一点红对照药材溶液5.阴性对照品溶液图2一点红薄层色谱鉴别图

2.1.3 岗梅根

取本品20mL，加乙酸乙酯萃取2次，每次25mL，合并乙酸乙酯液，置水浴上浓缩至1m L，作为供试品溶液。称取岗梅根对照药材5 g，加水60 mL，加热回流提取2 h，过滤，滤液浓缩至20m L，加乙酸乙酯萃取2次，每次25mL，合并乙酸乙酯液，置水浴上浓缩至1mL，即得岗梅根对照药材溶液。另取处方中无岗梅根的阴性样品，按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。照薄层色谱法，分别吸取上述3种溶液各5μL，点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯－乙酸乙酯－冰乙酸（5∶2∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯（365 nm）下检视，供试品溶液色谱中，在与岗梅根对照药材溶液色谱相应位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰(图3)。

2.2 桑叶中芦丁含量测定(高效液相色谱法)

2.2.1 色谱条件及系统适用性试验

色谱柱：Discovery C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇－0.1%磷酸溶液（35∶65）；检测波长：356 nm；柱温：35℃；流速：1.0mL／min；进样量：20μL。理论板数大于2 000。

2.2.2 溶液制备

对照品溶液：称取经120℃干燥至恒重的芦丁对照品2.50mg，精密称定，置25m L容量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，摇匀，即得（0.100 0mg／m L）。

1－3.供试品溶液4.岗梅根对照药材溶液5.阴性对照品溶液图3岗梅根薄层色谱鉴别图

供试品溶液：精密量取本品20mL，于水浴上蒸干，残渣加50%甲醇20mL溶解，置50mL具塞锥形瓶中，称定质量，超声提取30min，冷却至室温，补足减失的质量，摇匀，滤过，转移至25m L容量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

阴性对照品溶液：精密量取缺桑叶的阴性对照品溶液20 mL，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.2.3 方法学考察

专属性试验：分别精密吸取供试品溶液、对照品溶液和阴性对照品溶液各20μL，按拟订色谱条件进样测定，记录色谱图。结果表明，供试品溶液与芦丁对照品溶液色谱在相同保留时间处有色谱峰，阴性对照品溶液色谱在此保留时间处无色谱峰(图4)，阴性无干扰，表明方法具有专属性。

线性关系考察：精密吸取芦丁对照品溶液（0.100 0 g／L）0.2，0.3，0.4，0.5，1.0，2.0 m L，分别置10 m L容量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得2，3，4，5，10，20μg／mL 6个质量浓度的标准溶液。按拟订色谱条件，分别进样20μL，以峰面积(A)对质量浓度(C)进行回归分析，得回归方程A＝24 093C－10 173，r＝0.999 6 (n＝6)。结果表明，芦丁质量浓度在2～20μg／m L范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：取芦丁对照品溶液（0.100 0 g／L）重复进样6次，测定峰面积。结果的RSD为0.90%（n＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一供试品溶液，分别置于0，2，4，8，12，24 h时进样测定。结果峰面积的RSD为2.25%（n＝6），表明供试品溶液在24 h内稳定性较好。

A.对照品溶液B.供试品溶液C.阴性对照品溶液图4高效液相色谱图

重复性试验：取同一批样品，按2.2.2项下方法平行制备6份供试品溶液，按拟订色谱条件测定。结果芦丁的含量平均为15.49μg／mL，RSD为1.35%（n＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：精密量取已知含量的样品（批号为20140713）5 m L，各6份，分别精密加入芦丁对照品溶液，加低、中、高浓度各3份，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定含量，计算回收率。结果见表1。

2.2.4 样品含量测定

取3批样品，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，精密吸取样品溶液各20μL，按拟订色谱条件进样测定，计算样品中芦丁的含量。结果见表2。

3 讨论

清解雾化液中的桑叶、岗梅根、一点红、千里光为主产于广西的道地药材，资源广泛，在广西民间应用广泛。其中桑叶可祛风毒、解痧毒、清热毒，用于痧病、埃病（咳嗽）、兰奔(眩晕)、火眼(急性结膜炎)[3]等；岗梅能解热毒、通龙路，用于贫痧（感冒）、货烟妈（咽痛）、埃病（咳嗽）、肺痈[4]等；一点红具有通龙路火路、清热毒、祛风毒、除湿毒的功效，民间用于发旺（风湿骨痛）、笨浮（水肿）、埃病（咳嗽）、贫痧（感冒）、火眼、货烟妈（咽痛）、呗农（痈肿）[4]等，与中医药理论相符。桑叶对金黄色葡萄球菌等多种致病菌有抑制作用，桑叶含有挥发油，对散热有良好的疗效[5]。从岗梅根中分离得到的10个三萜及其皂苷类化合物，具有显著的抗炎、抗菌作用[6－7]。千里光具有抗炎、抗菌、抗急性肝损伤、抗癌等显著的药理活性[8－10]。

表1 清解雾化液中芦丁加样回收试验结果(n＝6)

表2 样品测定结果(n＝3)

建立薄层色谱鉴别法时，对桑叶的薄层色谱鉴别分别考察了展开系统甲苯－乙酸乙酯－甲酸（5∶3∶1）[11]、甲苯－乙酸乙酯－甲酸（8∶2∶1）[12]和氯仿－甲醇（13∶1），展开系统氯仿－甲醇（13∶1）分离效果好，斑点清晰，阴性无干扰。对一点红的薄层色谱鉴别分别考察了展开系统氯仿－甲醇－甲酸（30∶1∶0.1）、甲苯－乙酸乙酯－甲醇－甲酸（5∶4∶1∶1）、甲苯－石油醚－乙酸乙酯（13∶5∶1），结果甲苯－石油醚－乙酸乙酯（13∶5∶1）展开系统Rf值适中，因此采用此系统。对岗梅根的薄层色谱鉴别分别考察了甲苯－乙酸乙酯－冰醋酸酸（10∶3∶1）、甲苯－乙酸乙酯－冰醋酸酸（5∶2∶1），后者展开效果较好，分离斑点清晰。

建立高效液相色谱法时，根据芦丁可溶于热水、甲醇、乙醇的性能，本试验中采用了不同溶剂水、50%甲醇、80%甲醇、甲醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇提取芦丁，发现以50%甲醇提取最完全，样品分离最好，杂峰少。比较了超声提取时间（20，30，40，60min），发现超声提取30min即可提取完全，为了节省时间，选择提取时间为30 min。比较了甲醇－水、甲醇－醋酸和甲醇－磷酸等流动相系统及其比例，结果以甲醇－0.1%磷酸溶液（37∶63）得到的色谱峰分离度最好，基线平整，峰塔板数高，适合该制剂的测定。

本研究中对清解雾化液中的桑叶、岗梅根、一点红薄层色谱鉴别进行了提取方法和展开剂的筛选，得到的斑点清晰，可用于该制剂的药材鉴别。采用高效液相色谱法建立了制剂中芦丁的含量测定方法，操作简单，准确可靠，为建立清解雾化液的质量标准奠定了基础。

[1]莫小林，李伟伟，申燕燕，等.壮药清解雾化液的制备与治疗天行赤眼的疗效观察[J].广西中医药，2012，35（1）：39－40.

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Quality Standard of Qingjie A tom ized Liquid

Mo Xiaolin，Wu Xiaoyan，Gong Minyang，Chen Xiaoming，Wei Zhenyuan
（First Affiliated Hospital of Guangxi Traditional Chinese Medicine University，Nanning，Guangxi，China 530023）

Objective To establish the quality standard of Qingjie Atomized Liquid.M ethods The Morus Alba，Emilia Sonchifolia and Radix Ilicis Asprellae in the Qingjie Atomized Liquid were identified by thin layer chromatography（TLC）.The content of rutin in the Qingjie Atomized Liquid was determined by high performance liquid chromatography（HPLC）.The column was Discovery C18column（250 mm×4.6 mm，5μm）with mobile phase of methanol－0.1%phosphoric acid solution（35∶65），the detection wavelength was 356 nm，the flow rate was 1.0 m L／min，the column temperature was 35℃.Resu lts The TLC spots of Morus Alba，Emilia Sonchifolia and Radix Ilicis Asprellae were clear and showed negative control without interference.The concentration of rutin is linear in the range of 2－20 g／mL and had a good linear relationship with the peak area，r＝0.999 6，the average recovery was 99.92%，RSD was 0.99%（n＝6）.Conclusion The method is simple，specific and reproducible，which can be used for the quality control of Qingjie Atomized Liquid.

Qingjie Atomized Liquid；quality standard；TLC；HPLC；rutin

R284.1

A

1006－4931(2017)10－0027－04

2017－02－08)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.10.007

广西壮族自治区卫生厅中医药科技专项制剂类课题资助项目和医院制剂遴选课题[GZYZ1104]；全国中药特色技术传承人才培训项目[J20164811007]。

莫小林，副主任中药师，研究方向为制剂开发和质量标准，（电话）0771－5645433（电子信箱）moxiaolin＠163.com。

伍小燕，主任中药师，研究方向为中药鉴定和质量标准，（电话）0771－5848631（电子信箱）yxbwxy＠163.com。