天南星双向发酵炮制工艺研究

朱舟，伍朝君，陈玲

（1.重庆市中医院，重庆400021；2.四川省乐山职业技术学院，四川乐山614000）

·实验研究·

天南星双向发酵炮制工艺研究

朱舟1，伍朝君2，陈玲1

（1.重庆市中医院，重庆400021；2.四川省乐山职业技术学院，四川乐山614000）

目的研究白僵菌转化天南星固体发酵的条件，以达到解毒增效的目的。方法对菌株BT1转化天南星粗粉的固体发酵培养条件和培养基进行了优化试验，通过菌种活化、种子培养、固体发酵培养方法及正交试验考察了种子培养基、底物量、转化温度、转化时间4种因素的影响，优选最佳转化条件。结果白僵菌菌株BT1为优选出的最适宜试验菌株，其最佳培养条件为在YPD液体培养基中以28℃、200 r／min转速条件培养3 d作为种子；采用固体发酵方式，以中药天南星为底物，10%的接种量，28℃培养20 d为白僵菌的最佳转化条件；培养基组成为天南星粗粉－鲜豆渣－米粉(1∶1∶1)，含水量为50%时，能获得毒性较低、抗惊厥活性较高的炮制品。结论采用该条件发酵天南星，可达解毒增效目的。

天南星；白僵菌；双向发酵；炮制工艺

天南星为天南星科植物天南星Arisaema erubescens（Wall.）Schott.、异叶天南星Arisaema heterophyllum Blume或东北天南星Arisaema amurenseMaxim.的干燥块茎，主要含有生物碱、苷、黄酮、脂肪酸、挥发油等成分。天南星性温，味苦、辛，有大毒，归肺、肝、脾经，具有燥湿化痰、祛风定惊、消肿散结功效，临床可用于治疗顽痰咳嗽、风痰眩晕、中风痰壅、口眼斜、半身不遂、癫痫、惊风、破伤风等，功效卓著且应用广泛，但因其毒性较大，临床屡有用药不慎而导致中毒死亡的报道[1]。利用微生物固体发酵技术用于有毒中药的炮制，可达到减毒增效的目的。庄毅[2]、潘扬等[3]对马钱子的固体发酵研究使用了多种菌种，如槐耳、灵芝、猴头等减毒，效果均较明显。在增效方面，据卫生部药品检验所动物试验结果显示，发酵中药只需要1／28的量，即可与一般煎、煮、熬水提物1份的量发挥同等药效[4]。

本研究中采用双向固体发酵炮制工艺，以生天南星为药性基质，以白僵菌为发酵菌株，在一定条件下进行固体发酵，进行初步的发酵、化学、毒性、药效研究，并应用正交试验优选发酵工艺，获得有效的天南星发酵炮制品，为进一步研究发酵天南星的减毒增效方法奠定基础。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

紫外可见光分光度计（瑞士梅特勒－托利多公司）；GTR16－2型高速台式冷冻离心机（北京时代北利离心机有限公司）。

生品天南星，为天南星科植物天南星Arisaema erubescens（Wall.）Schott.，异叶天南星Arisaema heterophyllum Blume或东北天南星Arisaema amurense Maxim.的干燥块茎，批号为20160812，购自重庆市中药材公司；发酵基质(自配)；发酵菌株，球孢白僵菌Beauveria sp.(菌种编号为BNCC147472，北纳创联生物技术有限公司）；ABTS溶液(编号为BTN131114，北京奥莱博科技有限公司)；YPD液体种子培养基(产品货号为HB5193－1，青岛海博生物技术有限公司)；PDA斜面培养基（上海哈灵生物科技有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株筛选

斜面菌种活化：取冷藏的球孢白僵菌菌种，按照无菌操作要求转接至斜面培养基中，27℃避光培养7 d。

天南星初筛培养基制法：将天南星打成40目粉末，用水调至糊状，使天南星粉含量为15%，再加入1%的琼脂，加热使琼脂融化，装入三角瓶中，在121℃条件下高压灭菌30min，冷却至80℃后在无菌条件下倒入90mm平板中，备用。

白僵菌发酵菌株筛选：将白僵菌菌株活化的菌丝用无菌的打孔器打10mm菌块，在无菌条件下转接至天南星琼脂平板中央，置27℃培养箱中避光培养，将可在天南星琼脂平板上生长的菌株作为初筛的促发菌株；而后将初筛菌株的原种接在天南星粗粉（过40目筛）袋料培养基上，每组合接6袋，菌丝满袋后收获并以发酵组合的发酵性状、菌丝生长速度，菌丝满袋时间为指标，判定不同菌种的发酵情况，以能正常发酵，满袋时间短，发酵菌质情况良好的发酵菌株作为筛选双向发酵工艺的发酵菌株。

1.2.2 天南星发酵工艺优化筛选

漆酶是白僵菌菌丝体在基质上生长产生的酶[5－6]，能非特异性地降解木质素、芳香族化合物及多环芳烃等多种难降解的化合物，在自然界物质转化中起重要作用。初步试验发现，毒性较低、抗惊厥作用越强的菌质，发酵菌株产生的漆酶活性越大。这跟高慧娟等[7]报道的川芎增效作用与漆酶活性的关系结果类似。因此，本试验中以漆酶活性为指标筛选白僵菌双向发酵工艺。

液体种子制备：取筛选出的白僵菌菌株转接至PDA斜面培养基上，置温度为（28±1）℃，相对湿度为60%条件下培养7 d，4℃冰箱保存备用。无菌条件下将活化的白僵菌菌种接入YPD液体种子培养基（葡萄糖20 g／L，酵母粉5 g／L，KH2PO41.5 g／L，MgSO40.75 g／L，CaCO32.5 g／L，维生素B10.1 g／L），28℃、200 r／min黑暗条件下培养3 d，挑选液体澄清、菌球大小均匀者作为双向固体发酵的液体菌种备用。

双向发酵：取天南星药材适量，粉碎（过40目筛），鲜豆渣20 g，米粉20 g，混匀，含水量为50%，分装于发酵瓶中，121℃高压灭菌120min备用，作为药性基质。将白僵菌液体种子定量接种于该基质，黑暗条件下于恒温发酵室培养。

最佳固体转化条件确定：在以上试验基础上，选择种子培养基的接种量（因素A）、底物量（因素B）、转化时间（因素C）、转化温度（因素D）4个影响因素，各设3个水平进行正交试验，以漆酶活性为指标，以确定白僵菌转化天南星固体发酵的最佳条件。

漆酶测定：采用ABTS法[8]测定，取含鲜菌丝天南星菌质5 g，加入5倍体积蒸馏水轻轻研磨后，4℃、3 000 r／min离心20min，取上清液即为粗酶液。取2.9m L 0.5mmol／L ABTS溶液置1 cm比色皿中，迅速转至30℃水浴中预热5 min，移取0.1 m L稀释6 000倍的粗酶液启动反应，在420 nm波长处测定4min内的吸光度（OD值）变化，记录ΔOD值。每分钟氧化1μmol ABTS所需的酶量为1个酶活单位。根据以下公式求出漆酶（Lac）活性。

其中，消光系数ε＝3.6×104L／（mol·cm），n为酶液稀释倍数。

2 结果

2.1 发酵菌株筛选

不同白僵菌菌株在天南星平板培养基上的生长情况见表1。筛选可得BT1和BT5 2个菌株，其生长良好，且生长速度快，菌丝洁白，菌丝活力好。

不同白僵菌菌株在生天南星药性基质中的生长适应性各不相同，详见表2。根据菌丝生长速度、菌丝满袋时间、菌丝外观等判定菌株的发酵情况，并据此选择最适合在天南星药性基质上生长的菌株BT1为酵制天南星的发酵菌株。

2.2 正交试验结果

结果见表3和表4。可见，最优组合为A2B3C1D2，因素主次为C＞D＞A＞B。即接种量为10%，底物量为20 g，转化时间为20 d，转化温度为28℃。

2.3 最佳工艺验证

结果见表5。

表1 白僵菌菌株在天南星平板培养基上的生长情况

表2 不同白僵菌菌株在天南星药性基质上的发酵情况

表3 因素水平表

表4 L9（34）正交试验设计及直观分析结果(n＝9)

表5 最佳工艺验证试验结果

2.4 最佳固化培养配方确定

白僵菌双向发酵天南星最佳固化培养配方为500m L玻璃瓶中装天南星粗粉20 g，鲜豆渣20 g，米粉20 g，起始含水量为50%，并以此为培养基；最佳转化条件为YPD液体培养基中以28℃、200 r／min条件培养3 d作为种子，以10%的接入量接入固体转化培养基，28℃培养20 d。

3 讨论

“双向发酵”[9－11]主要以植物来源的药材为“药性基质”（含营养成分），由经过筛选的药用真菌进行固态发酵，在经历复杂的真菌生长的生理、生化过程后，形成药性和功能主治与原药材不完全相同的“药性菌质”。由于这种发酵技术既能让药材营养物质为真菌生长所利用，又能使药材原有的化学成分在真菌体内酶的催化下发生转变，因而被称为“双向发酵”。“双向发酵”是一种现代纯种发酵工艺，旨在为研制一类原创中药新药——“菌质”提供理论依据和实践方向，但由于“双向发酵”本身源于传统的发酵法，属于中药炮制学的范畴。研究表明，双向固体发酵技术不仅可用于毒性中药的减毒[12]，还可提高某些中药的疗效。这种属于中药生物技术范畴的药用真菌，为中药的二次开发及新药的研制等提供了崭新的发展方向，而各种不同的菌质将构成中药的新领域，发展前景广阔。采用菌种固定的“双向发酵”工艺对毒性中药进行减毒的系统研究[13]，避免产生毒素的杂菌污染，才能保证发酵生产的稳定及产品的质量和安全，并能方便对发酵生产过程进行数字化管理，是完全适合中药现代化需求的新途径。

本研究中采用白僵菌对天南星进行固体双向发酵炮制，结果显示，生品天南星经药用真菌发酵后，改变了原药材的形态及性状。白僵菌[14－15]为半知菌类虫生真菌，也是具有广谱性的昆虫病原真菌，这类真菌含有蛋白酶、脂肪酶，前期研究已显示，它们在富含毒蛋白、脂肪酸、淀粉质的天南星上易于生长。因此，用白僵菌发酵天南星减毒有充分的理论依据和工作基础。最佳固体发酵工艺验证结果，2 000 g天南星药性基质中接种菌株，发酵中试生产，经发酵炮制干燥后，共获得1 697 g酵制天南星成品，得率为84.85%，获得的酵制天南星成品菌质表面呈类白色，粗糙，附有白色或淡黄色粉霜，质硬而脆，断面酥松，夹杂有白色或淡黄色粉霜，气微辛，味微麻。经初步急性毒性试验观察，酵制天南星炮制品毒性大大降低，60%乙醇提取物小鼠1次灌胃，生品天南星的半数致死量(LD50)为（145.0±8.3）g／kg，酵制天南星炮制品的LD50为（295.47±25.23）g／kg。药效学试验表明，酵制天南星炮制品抗惊厥效果与生品相差不大，说明经双向发酵炮制后，降低了药材毒性而保持了疗效，基本达到了研究目的，证明白僵菌对天南星进行固体发酵炮制方式在天南星药材解毒增效中的可行性，但其转化机制有待进一步深入研究。

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Bidirectional Ferm entation Processing Technology of Arisaema Heterophyllum

Zhu Zhou1，Wu Chaojun2，Chen Ling1
（1.Chongqing Hospital of Traditional Chinese Medicine，Chongqing，China 400021；2.Leshan Vocational and Technical College，Leshan，Sichuan，China 614000）

Ob jective To study the condition of solid fermentation of Beauveria Bassiana for transforming Arisaema Heterophyllum，in order to achieve the purpose of detoxification and synergism.M ethods The solid fermentation culture conditions and the medium of strain BT1 for transforming the dry powder of Arisaema Heterophyllum were made for the optimization test.The effects of 4 factors，such as seed culture medium，substrate input，transition temperature and transition time were investigated by orthogonal test and the strain activation，seed culture，solid fermentation culture methods.The optimum conditions for transformation were optimized.Results The Beauveria Bassiana strain BT1 is the most suitable test strain，the best condition when the strain of Beauveria Bassiana BT1 was cultured in the YPD liquid medium under 28℃and 200 r／min for 3 d was optimum.The optimum transition condition of Beauveria Bassiana strainwas as follows：taking Arisaema Heterophyllum as the substrate with inoculation amount of 10%and culturing for 20 d at 28℃by using the solid fermentation method.When the medium compositions was Arisaema Heterophyllum powder，fresh bean cake and rice flour with ratio of 1∶1∶1 and the water content as 50%,the transition product with lower toxicity and higher activity of anti convulsion was obtained.Conclusion Using this fermentation condition for transforming Arisaema Heterophyllum can achieve the purpose of etoxification and synergism.

Arisaema Heterophyllum；Beauveria Bassiana；bidirectional fermentation；processing technology

R282.7；R943.1

A

1006－4931(2017)10－0007－04

2017－01－08；

2017－02－11)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.10.002

重庆市卫生和计生委中医药科技项目[ZY20150236]。

朱舟，女，大学本科，主任中药师，研究方向为中药炮制及传统工艺，（电子信箱）zzlxrg＠163.com。

伍朝君，女，大学本科，副教授，研究方向为中药药理学，（电子信箱）wuchaojun11x＠163.com。