关于CRISPR/Cas9基因编辑技术的研究进展及应用前景

刘慧，简洁雯

信阳职业技术学院检验学院

关于CRISPR/Cas9基因编辑技术的研究进展及应用前景

刘慧，简洁雯

信阳职业技术学院检验学院

1 、研究目的

所谓的基因编辑技术指的就是研究人员为了使得特定的某种目的能够被达成，而去修饰动物的遗传组成的过程，这以技术综合性以及挑战性相对较强，其对于整个基因遗传学的发展有着极为重要的意义。基因编辑技术的应用能够使得相关人员精确的对DNA进行添加、删除、置换操作，进而使得基因能够依照人们意愿所呈现。CRISPR/Cas9系统是通过对一种RNA的调控来达到DNA修饰的目的的基因编辑工具，其本质为叫锌指核酸酶和转录激活因子样效应物核酸酶，和其他基因编辑工具相比，此种基因编辑工具打靶在标准型以及高效性上所具有的优势性更加明显，并且其在设计上更加容易操作，所具有的特异性也更加突出。

2 、研究现状

CRISPR/Cas9的兴起时间是1987年，研究人员以日本科研人员为主，其在大肠杆菌的基因组中发现了以相互间隔状态所存在的短文序列，这些短文序列的存在可以在一定程度上给予细菌和古细菌免疫性，基于这一点当时就有研究人员提出CRISPR/Cas9可能会在DNA修复系统中起到作用。CRISPR/Cas9主要存在于原核生物中，绝大多数的古细菌以及细菌都会具备此种蛋白免疫系统，这为CRISPR/Cas9基因编辑技术的进一步研究创造了条件，在最开始的时候CRISPR/Cas9系统并不能够直接应用到人或动物上，只有通过一定的改造手段对其进行改造才能够使其成为把核酸酶作为核心的基因编辑技术并加以应用。在2002年，相关研究人员以原核生物为对象进行了生物信息学的分析，分析结果表明短文序列主要存在的品种为原核生物，这和上文的研究结果是能够达成一致的，此外研究人员也指出重复序列在不同原核生物的长度是有一定差别的，一般长度为21bp到37bp之间，并且其在存在过程中也会被某些非重复序列所隔开，在这个时期研究人员才把该基因家族定义为CRISPR（Jansen etal.2002）。此外在此研究中也对CRISPR的位点进行了分析，分析表明CRISPR位点侧翼区是一个先导序列，先导序列的长度为300到500bp之间。前导序列和重复序列之间存在一定的联系，一般情况下同一个物种中两者之间的保守程度相对较大，不同物种中所呈现的变异性则相对较为突出。同时每个物种中存在不同CRISPR位点的可能性也是非常大的。（Jansen et al.2002）。

在2005年，著名学者Pourcel C为了对CRISPR/Cas9间隔序列进行进一步的研究与探讨，以三种鼠疫杆菌为对象对CIRPSR位点进行了测序处理，测序完成后其发现了29个新的间隔序列，这些间隔序列存在一定的差异性。此外其还对9株鼠疫杆菌株进行了实验，在9株鼠疫杆菌株中，发现的间隔序列达到了132个，所发现的这些间隔序列在摆脱那个菌株中以相同状态所存在的数量只有三个，其他的序列都以不同状态所存在（Pourcel et al.2005）。研究学者Mojica等在2005年通过实验也发现了CRISPR间隔序列和外源质粒的同源性是非常高的，当噬菌体或者外源质粒受到细菌的再次感染时，间隔序列的细菌可以起到组织噬菌体以及外源致粒再次入侵的作用。（Mojica et al.2005）。著名学者Bolotin为了对间隔序列进行进一步的了解而进行了噬菌体敏感性实验，实验结果表明间隔序列的主要来源为外部的噬菌体以及基因组，进而可以得出原核生物的CRISPR位点本质上其实就是外援病毒以及噬菌体在对细菌入侵过程中所留下的痕迹，其和细菌的免疫机制有着一定的联系。Bolotin et al.2005；Barrangou et al.2007）。

Cas蛋白是CRISPR/Cas系统的重要组合部分之一，其在整个CRISPR/Cas9基因编辑技术作用发挥过程扮演着极为重要的角色。在2005年，Haft等研究学者就通过对生物信息学的应用发现了45种Cas蛋白，其中和DNA修复有着密切关系的的Cas蛋白种类为Csm3-5,Cmrl,Cmr3,Cmr4,Cmr6和Csx7蛋白（Haft et al.2005）。在所有的Cas蛋白中，存在于古细菌以及绝大部分细菌中的是Casl-6，其他种类的Cas蛋白则具备一定的种属特异性（Ternsand Terns 2011）。Cas1和Cas2蛋白在细菌免疫处于干扰阶段时并不会发挥出作用，但是在实验中发现这两种蛋白都具有一定的核算内切酶的火星，因此其在间隔序列中起到的作用也是非常重要的。

3 、CRISPR/Cas9技术的在动物基因组编辑研究中的应用

基因编辑动物的获得是科学领域研究基因技术的一个突破，由于CRISPR/Cas9系统所具有的高效、简单等优势，在其得到研究开发后被广泛应用到生物遗传改造中。在2013年，Cong等通过对源于酿弄链球菌CRISPR/Cas9系统的构建实现了对人体293FT细胞EMX1、PVALB位点的切割（Cong et al.2013）。

同年，Mali等则以内源性的AAVSI基因为对象，通过CRISPR/ Cas9技术的应用使得293T细胞、K562细胞以及IPS细胞得到一定程度的敲除（Mali et al.2013b）。

T细胞在人体血液循环过程以及免疫过程中扮演着极为重要的角色，其是未来医药技术开发过程中重点开发的靶点细胞之一，T细胞基因组的研究与开发会在一定能够程度上为癌症、艾滋病等免疫性疾病的研究提供更多的可能性。在2013年，Ebina等研究人员通过靶向HIV-1 LTR的CRISPR/Cas9系统的利用使得HIV-1的LTR得到启动并表达，并诱发了T细胞的产生。

[1]李响,董波.CRISPR/Cas9技术及其在海洋生物中的应用现状与展望[J].水生生物学报,2017,41（1）:244-256.

[2]任文琳,张俊,徐桂霞,等.CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术及其在RNA编辑中的潜在应用[J].生物技术进展,2017（1）:1-6.