小孢子技术在甘蓝类蔬菜育种中的应用

朱惠霞，陶兴林，胡立敏，刘明霞

（甘肃省农业科学院蔬菜研究所，甘肃 兰州 730070）

甘蓝类蔬菜是十字花科芸薹属甘蓝种中1年或2年生蔬菜的统称，染色体组CC（2n=18），包括芥蓝和甘蓝的一系列变种，甘蓝变种主要有结球甘蓝、皱叶甘蓝、紫甘蓝、抱子甘蓝、羽衣甘蓝、球茎甘蓝（苤蓝）、花椰菜、青花菜等。甘蓝类蔬菜常规育种方法是利用不育系和自交不亲和系进行杂交育种，通常需要6～7年的自交才能获得遗传稳定、高度纯合的亲本自交系，育种周期长，选择效率低，而利用游离小孢子培养技术可以短期内获得大量的单倍体，经过加倍后的双单倍体（Double Haploid，简称DH）植株变异丰富，遗传稳定，2年内即可获得纯合的自交系，筛选鉴定后可直接应用于育种程序，能大大加快新品种的选育速度[1-3]。小孢子技术与传统育种技术的结合为甘蓝类蔬菜优良种质资源的获得和新品种的培育创建了一条新途径，小孢子技术的研究和利用也成为近年来育种专家们研究的新方向。小孢子技术在甘蓝类蔬菜育种中具有重要的应用价值，是创造变异和创新育种材料的主要方法之一。本文主要综述了甘蓝类蔬菜小孢子技术发展概况和应用情况，并对未来的研究发展方向进行了展望，以期为进行相关研究的人员提供一定的参考。

1 甘蓝类蔬菜小孢子育种技术发展概况

甘蓝类蔬菜游离小孢子培养由Lichter[4]和Takahata等[5]在羽衣甘蓝、结球甘蓝中首次取得了成功，随后又在花椰菜、青花菜、芥蓝上得到了再生植株[6]，Duyijis等[7]在球茎甘蓝、皱叶甘蓝、孢子甘蓝上获得成功。张德双等[8]首次对青花菜进行了游离小孢子培养，并获得了再生植株；严准等[9]在甘蓝、青花菜、苤蓝上进行小孢子培养，首次在苤蓝中培养成功。近20年来，国内陆续对甘蓝、芥蓝、花椰菜、羽衣甘蓝等开展了小孢子培养技术研究[10-13]，对影响小孢子出胚的主要因素，如材料的基因型、花蕾取样时期、培养基成分、预处理方式等方面进行了大量研究[14-23]，经过多年的研究和改进，游离小孢子培养技术日趋成熟，到目前为止，几乎所有的甘蓝类蔬菜都进行了小孢子技术研究，成功建立了小孢子培养技术体系[24-29]，并逐步应用于育种实践。

1.1 筛选出一批具备小孢子培养特性的基因型材料

相比于其他十字花科蔬菜作物，在小孢子培养中，甘蓝类C基因组蔬菜是最难出胚的一类，试验材料的基因型是影响胚产量的主要因素。不同材料的出胚能力差异很大，一些基因型材料出胚率很高，例如甘蓝品种中甘11[20]、万福[21]、寒玉37[30]，球茎甘蓝东川苤蓝[31]，羽衣甘蓝桃舞[22]，花椰菜品种耐热50、大圣160[15]，青花菜品种绿洲808[14]，松花菜品种厦雪40、白虎早生种[27]，芥菜翠宝[32]等，而大部分的基因型材料出胚率较低，甚至不出胚。对甘蓝品种表型与出胚难易关系研究发现，拥有早熟、球形、春甘蓝3种特性的甘蓝易出胚，而扁球、中熟、晚熟、越冬甘蓝不易出胚[33]，而花椰菜小孢子出胚多少与花球松紧度并无明显关联[34]。由于在小孢子培养技术研究前期，必须通过大量的材料筛选找到一些易出胚的基因型材料作为小孢子培养的骨干材料，进行体系优化和完善，因此，通过研究相关文献列出了一些出胚较高的基因型材料，供初期的研究者参考（表1）。

1.2 利用小孢子技术培育出一批甘蓝类蔬菜新品种

目前，小孢子技术已成为甘蓝类蔬菜育种的主要方法之一，通过小孢子培养获得DH株系，并从中选出性状优良的株系进行杂交组合配制，即可在4～5年内选育出优良新品种。2002年，张晓伟等[37]用小孢子技术育成第1个甘蓝品种，到目前为止，全国已育成甘蓝类蔬菜品种14个，其中松花菜4个、甘蓝8个、青花菜2个（表2）。但研究文献发现，近年来，中国甘蓝类蔬菜品种大多还是利用传统育种技术育成，如自交不亲和系，细胞质雄性不育系和核不育系，利用小孢子技术的品种相对较少，究其原因，小孢子技术从建立培养体系到进入育种应用程序需要一个长期的过程，必须突破基因型材料的限制，突破出胚难、出胚率低的瓶颈，而得到的DH植株也必须经过筛选鉴定才能进入育种程序，期间需要投入大量的试验成本，这严重制约了小孢子技术在育种实践中的应用速度。现阶段成功培育出新品种的单位大多经过10多年的研究积累，已经拥有成熟的技术和完整的育种评价体系，而对于大多数研究者来说，小孢子技术还未达到程序化、规模化应用的阶段。

表1 高出胚能力的基因型材料

表2 利用小孢子技术育成的甘蓝类蔬菜新品种

2 小孢子技术在甘蓝类蔬菜育种中的应用

2.1 利用远缘杂交或种间杂交与小孢子技术相结合创制育种新材料

远缘杂交在甘蓝类蔬菜育种中被广泛应用，若杂种花粉可育，则可结合小孢子技术进行种质资源再创造。目前，已进行小孢子培养的杂种有青花菜×甘蓝、甘蓝×花椰菜[51]、broccoli×white-headed cabbage hybrids[28]。有研究表明，甘蓝类蔬菜的小孢子胚胎发生能力是可以遗传的，对种间杂交种进行小孢子培养，产胚能力取决于2个亲本的胚胎发生能力，杂种1代小孢子产胚率与具高胚发生能力的亲本相近，或与中亲值接近[51]。因此，可以通过品种杂交的手段，将难出胚材料与高出胚材料杂交，使控制高胚发生能力的遗传因子导入到无胚发生能力的材料中，通过遗传改良的方法扩大能诱导出小孢子胚胎发生的基因型范围[52]。胡永霞[53]以大白菜-结球甘蓝3号单体异附加系为材料，进行小孢子游离培养，对获得的小孢子植株进行细胞学、形态学及InDel标记鉴定，筛选出携带甘蓝优良性状基因的易位系新种质，建立了大白菜-结球甘蓝异源易位系的高效诱导及鉴定方法。

2.2 利用小孢子技术进行抗病、抗逆种质的筛选

甘蓝类蔬菜常见病害有霜霉病、黑根病、黑斑病、灰霉病、黑腐病、细菌性黑斑病、菌核病、根肿病、枯萎病等。目前，最主要的病害是甘蓝枯萎病、花椰菜根肿病，其已严重影响了产量和品质，且危害逐年加重，而应对病害最有效的方式是使用抗病品种，利用小孢子技术建立DH群体后，结合分子标记和抗性鉴定，可筛选出抗病且性状优良的DH系，其可用于配制杂交组合，使得原本需要7～8年的育种进程缩短至3～4年。吕红豪[54-55]首次利用小孢子培养的DH群体和F2群体对甘蓝抗枯萎病基因进行了精细定位，分析获得了甘蓝抗枯萎病候选基因FOCI，对候选基因进行了验证，并利用小孢子培养结合分子标记辅助选择的方法创制了新材料，促进了甘蓝抗枯萎病育种技术的快速发展。

2.3 小孢子技术与诱变技术相结合创制突变体

游离小孢子培养技术的日益成熟为离体诱变提供了新途径。相比传统的诱变技术，诱变小孢子比种子更加敏感，有利于提高诱变率，且能产生大量的胚状体，增加了获得有益突变性状的可能性，并可以在DH植株中快速筛选出纯合的目标突变性状。目前常用的物理方法是用60Co-γ射线处理单核靠边期的花蕾后进行小孢子培养，化学方法则是用不同浓度的甲基磺酸乙酯（EMS）处理分离纯化后的小孢子，再进行培养。代双艳[56]利用EMS诱变大白菜花蕾并结合游离小孢子培养，获得了叶形、叶色、花冠大小、花色、抽薹性、抗霜霉病上的基因型纯合突变体74株。黄胜楠[57]利用60Co-γ射线诱变处理小孢子发育处于单核靠边期的花蕾后进行小孢子培养，获得了花瓣退化、生育迟缓、雄性不育、叶片黄化和不结球等特性的突变体材料5份，用EMS诱变处理分离纯化后的小孢子，再进行培养，获得了雄性不育、早抽薹、生长缓慢、叶片黄化和叶球变长等性状的突变体材料7份，并利用获得的突变体材料进行了基因功能组学研究，而在甘蓝类蔬菜上还未见相关报道。因此，今后应将小孢子培养技术与诱变相结合，快速创制纯合的甘蓝类蔬菜突变体。

3 问题及展望

小孢子培养技术在品种改良和新种质创制方面具有十分重要的地位和意义。可进行双单倍体育种、突变育种、转基因育种等，目前几乎所有的蔬菜育种单位都开展了相关研究，尤其在十字花科类蔬菜上技术比较成熟，但基本需要10多年的研究积累。只有建立完整有效的小孢子单倍体育种综合体系，其才能逐步应用于育种实践。目前，小孢子技术的优势还未能充分发挥出来，因此，今后将进一步优化技术突破出胚率普遍较低的瓶颈，而如何把小孢子培养育种技术与常规育种技术相结合，节省育种成本，加快育种进程，拓宽应用范围等问题，也值得被进一步研究和探索。

[1] 刘玉梅,方智远.我国甘蓝新品种选育与育种技术研究简述[J].当代蔬菜,2006(10):16-17.

[2] 赵前程,吉立柱,蔡荣旗,等.花椰菜游离小孢子培养及植株再生[J].华北农学报,2006,22(6):65-68.

[3] 佟智慧.青花菜(Brassica oleraceaL.)游离小孢子培养技术研究[D].福州:福建农林大学,2009.

[4] LINHTER R. Effcient yield of embryoids by culture of isolated microspores of differentBrassica ceaespecies[J].Plant Breeding, 1989,103(2):119-123.

[5] TAKAHATA Y, KELLER W A. High frequency embryogenesis from microspore culture ofB. oleracea[J].Japanese journal of breeding, 1990,40(1):134-135.

[6] TAKAHATA Y. High frequency embrygenesis and plant regeneration in isolated microspore culture ofBrassica oelraceaL.[J].Plant Science, 1991,74:235-242.

[7] DUYIJIS J C, VOORRIPS R E, VISSER D L.Microspore culture is successful in most crop types ofBrassica oleracea[J].Euphytica, 1992,60(1):45-55.

[8] 张德双,曹鸣庆,秦智伟.绿菜花游离小孢子培养、胚胎发生和植株再生[J].华北农学报,1998,13(3):102-106.

[9] 严准,田志宏,孟金陵.甘蓝游离小孢子培养的初步研究[J].华中农业大学学报,1999,18(1):5-7.

[10] 杨丽梅,方智远,刘玉梅,等.利用小孢子培养选育甘蓝自交系[J].中国蔬菜,2003(6):31-32.

[11] 何杭军,王晓武,汪炳良.芥蓝游离小孢子培养初报[J].园艺学报,2004,31(2):239-240.

[12] 顾宏辉,唐桂香,张国庆,等.冬性花椰菜的小孢子胚诱导和植株再生研究[J].浙江大学学报(农业与生命科学版),2004,30(1):34-38.

[13] 姜凤英,冯辉,王超楠.羽衣甘蓝的小孢子胚诱导和植株再生[J].植物生理学通讯,2006,41(6):725-727.

[14] 方淑贵,陈文辉,曾小玲,等.影响青花菜游离小孢子培养的若干因素[J].福建农林大学学报(自然科学版),2005,34(1):51-55.

[15] 方淑桂,朱朝辉,曾小玲,等.花椰菜游离小孢子培养及影响因子[J].福建农业学报,2006,21(2):138-142.

[16] 刘艳玲,简元才,李成琼,等.结球甘蓝游离小孢子培养胚发生能力的研究[J].西南农业大学学报(自然科学版),2006,28(3):439-446.

[17] 冯辉,郭姝,冯建云,等.菜用羽衣甘蓝的小孢子胚诱导和植株再生[J].园艺学报,2009,36(4):587-592.

[18] 王超楠,闻凤英,刘晓晖,等.球茎甘蓝小孢子培养中影响胚诱导的几个因素[J].中国蔬菜,2010(10):35-39.

[19] 曾爱松,冯翠,高兵,等.结球甘蓝小孢子培养技术体系的优化研究[J].华北农学报,2010,25(增刊1):40-44.

[20] 冯翠.结球甘蓝和青花菜游离小孢子培养技术的优化[D].南京:南京农业大学,2011.

[21] 马勇斌.甘蓝小孢子培养几个因素探讨和DH植株再生技术研究[D].杨凌:西北农林科技大学,2011.

[22] 戴希刚,施雪萍,包满珠.基因型条件对羽衣甘蓝小孢子胚胎发生的影响[J].植物生理学报,2012,48(11):1113-1119.

[23] 孙继峰,方智远,袁素霞,等.不同温度预处理对青花菜小孢子胚胎发生的影响[J].园艺学报,2015,42(3):563-568.

[24] 姜凤英.羽衣甘蓝游离小孢子培养体系的构建及应用[D].沈阳:沈阳农业大学,2006.

[25] 毛忠良,张振超,姚悦梅,等.羽衣甘蓝小孢子胚胎发生观察及再生植株倍性鉴定[J].西北植物学报,2012,32(10):2016-2022.

[26] 张振超,耿鑫鑫,戴忠良,等.甘蓝类植物小孢子培养及植株再生研究[J].核农学报,2013,27(7):929-937.

[27] GU H H, ZHAO Z Q, SHENG X G, et al. Efficient doubled haploid production in microspore culture of loose-curd cauliflower (B. oleraceavar.botrytis)[J].Euphytica, 2014,195(3):467-475.

[28] ZENG A S, YAN J Y, SONG L X, et al. Induction and development of microspore-derived embryos in broccoli white-headed cabbage hybrids microspore culture[J].Euphytica, 2015, 203(2):261-272.

[29] 王玉书,王欢,范震宇,等.观赏羽衣甘蓝小孢子培养及再生植株倍性变异[J].核农学报,2015,29(6):1037-1043.

[30] 曾爱松,高兵,宋立晓,等.耐寒结球甘蓝小孢子培养及其发育过程[J].中国农业大学学报,2015,20(2):86-92.

[31] 王超楠,闻凤英,刘晓晖,等.球茎甘蓝游离小孢子培养技术初步研究[C]//中国园艺学会十字花科分会第六届学术研讨会论文集.武汉:中国园艺学会十字花科分会,2009:4.

[32] 赵前程,李素文,文正华,等.芥蓝游离小孢子培养及植株再生研究[J].北方园艺,2007(9):4-6.

[33] 曾爱松,宋立晓,高兵,等.结球甘蓝小孢子胚植株再生技术体系的优化[C]//中国园艺学会十字花科蔬菜分会第十届学术研讨会论文集.天津:中国园艺学会十字花科蔬菜分会,2012:8.

[34] 顾宏辉,朱丹华,杨加付,等.早熟花椰菜小孢子高效胚胎发生及植株再生[J].浙江农业学报,2006,18(5):365-368.

[35] 桑玉芳,张恩慧,杨安平,等.甘蓝游离小孢子培养中影响胚状体形成的主要因素[J].西北农业学报,2007(2):125-129.

[36] 单晓政,文正华,刘莉莉,等.松散型花椰菜游离小孢子培养影响因素研究[C]//中国园艺学会十字花科蔬菜分会第十届学术研讨会论文集.天津:中国园艺学会十字花科蔬菜分会,2012:4.

[37] 张晓伟,高睦枪,耿建峰,等.利用游离小孢子培养育成早熟春甘蓝新品种"豫生1号"[J].园艺学报,2001,28(6):577.

[38] 张晓伟,姚秋菊,蒋武生,等.利用游离小孢子培养技术育成甘蓝新品种"豫生4号"[J].园艺学报,2008,35(7):1090.

[39] 姚秋菊,张晓伟,王志勇,等.甘蓝新品种"豫甘5号"的选育[J].中国瓜菜,2015,28(6):36-38.

[40] 曾爱松,高兵,宋立晓,等.秋季专用牛心甘蓝新品种锦秋55的选育[J].江苏农业科学,2015,43(11):230-231.

[41] 曾爱松,宋立晓,高兵,等.秋季专用平头甘蓝新品种锦秋60的选育[J].长江蔬菜,2015(4):10-12.

[42] 许忠民,张恩慧,程永安,等.甘蓝新品种"秦甘1265"[J].园艺学报,2015,42 (7):1413-1414.

[43] 张晓伟,姚秋菊.早熟秋甘蓝新品种豫甘3号[J].长江蔬菜,2016(3):17.

[44] 曾爱松,宋立晓,高兵,等.早熟秋甘蓝新品种"苏甘55"[J].园艺学报,2016,43:1-2.

[45] 顾宏辉,赵振卿,虞慧芳,等.花椰菜新品种"浙801"[J].园艺学报,2011,38(6):1213-1214.

[46] 顾宏辉,赵振卿,盛小光,等.松散型花椰菜新品种"浙017"[J].园艺学报,2012,39(8):1620-1622.

[47] 顾宏辉,赵振卿,盛小光,等.松散型花椰菜新品种"浙091"[J].园艺学报,2013,40(12):2537-2538.

[48] 赵振卿,盛小光,王建升,等.松花菜新品种浙农松花50天的选育[J].长江蔬菜,2016(12):34-35.

[49] 顾宏辉,虞慧芳,许映君,等.青花菜海绿的选育及特征特性[J].浙江农业科学,2014(1):52-53.

[50] 江汉民,孙德岭,姚星伟,等.青花菜新品种"领秀一号"的特征特性及栽培要点[J].北方园艺,2015(6):55-57.

[51] 陈文辉,方淑桂,曾小玲,等.甘蓝和青花菜杂种小孢子培养[J].热带亚热带植物学报,2006(4):321-326.

[52] 申书兴.大白菜成套初级三体的创建及其特性研究[D].南京:南京农业大学,2007.

[53] 胡永霞. 添加甘蓝3号染色体片段的AT3-11等大白菜易位系筛选及鉴定[D].保定:河北农业大学,2014.

[54] 吕红豪.甘蓝抗枯萎病基因的定位和克隆[D].北京:中国农业科学院研究生院,2014.

[55] LU H H, WANG Q B, YANG L M, et al. Breeding of cabbage(brassica oleraceaL. var.caoitata) with fusarium wilt resistance based on microspore culture and marked-assisted selection[J]. Euphytica, 2014,200(3):465-473.

[56] 代双艳.EMS诱变花蕾结合小孢子培养获得大白菜突变体的研究[D].保定:河北农业大学,2013.

[57] 黄胜楠.小孢子培养结合诱变处理创制大白菜突变体及其功能基因组学研究[D].沈阳:沈阳农业大学,2016