三种蔬菜对水中四环素的吸收累积效应

崔诗瑶，李 婧，曹海艳，范力博，苏玉红

（新疆大学化学化工学院，新疆 乌鲁木齐 830046）

四环素是四环素类广谱抗菌剂的一种，常用于人畜预防、治疗细菌性感染疾病，被人畜服用后，70%以上的药品不能被完全吸收，通常以原药或代谢产物的形式随粪尿排出体外[1-2]。据报道，2013年中国抗生素年使用量达16.2万t，约占世界用量的1/2，其中52%为兽用，48%为人用，超过5万t抗生素被排放到水土环境中[3-4]。这些抗生素在环境介质中虽然以痕量水平存在，但是长期暴露在此浓度下的动植物、微生物仍会受到影响，如携带抗性基因的抗性细菌的产生[5-7]，对蔬菜种子发芽及生长产生影响[8-10]。此外，研究者在肉类[11-12]及蔬菜[13-14]中也检出了多种抗生素，而研究表明来自食品的抗生素暴露与儿童肥胖发生风险之间呈正向相关[15-16]。

研究报告表明，土壤中的抗生素能被不同作物吸收并在体内不同部位累积[17]，所检测到的含量为各种抗生素在植物体内的累积总量，难以用于判断抗生素在植物体内的吸收、传输效率和累积速率；此外，根际分泌物对植物吸收、累积TC的影响尚未见报道，抗生素在土壤—植物系统内的迁移和转换规律尚未摸清。因此，本研究以酸性水溶液提取-SPE富集浓缩（自制MIP-SPE小柱）-高效液相色谱法测定的方法，拟研究根际暴露时间不同时，TC在小白菜、木耳菜和大白菜3种水培蔬菜叶中的含量及其累积速率，考察24 h处理后3种蔬菜不同部位TC含量分布，并初步探索根际分泌物对植物吸收与传输TC的影响。研究结果可为进一步研究抗生素在土壤—植物系统中的迁移规律，建立蔬菜中抗生素迁移模型，对蔬菜中抗生素通过食物链带来的健康风险评价提供依据。

1 材料和方法

1.2 试验材料

1.2.1 供试蔬菜

小白菜品种：上海青（南京金盛达种子有限公司），大白菜品种：吉祥美味快菜（青岛申荣农业发展有限公司）。种子经H2O2（30%）催芽后用蒸馏水发芽1周，转移至营养液中培养1个月备用。木耳菜成株购于乌鲁木齐市南公园，在营养液中缓苗1周备用。

1.2.2 供试药剂

盐酸四环素标准品（TC，98%），北京百灵威化学技术有限公司；乙腈（色谱纯），北京百灵威化学技术有限公司；甲醇、冰乙酸、盐酸、磷酸均为分析纯，购自天津市百世化工有限公司。

1.2 仪器与设备

JY92-ⅡN超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；TBL80-2B离心机（上海安亭科学仪器厂）；P230Ⅱ高效液相色谱仪配备紫外-可见检测器（大连依利特股份有限公司）；SHB-III循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；PHS-3C精密pH计（上海雷磁厂）；FDY2002-SUV超纯水仪（富勒姆科技有限公司）。

1.3 HPLC分析条件

Spursil C18色谱柱（5 μm×4.6 mm×250 mm）；检测波长270 nm；进样量10 μL；流动相为乙腈︰0.01 mol/L磷酸水溶液（20︰80，V︰V）。

1.4 抗生素根际暴露试验、样品采集与前处理方法

试验设4个处理，用蒸馏水配制2组不同TC浓度的营养液，浓度分别为5 mg/L和10 mg/L，即为T1和T2；用未处理的预培蔬菜根际液配制另外2组不同TC浓度的营养液，浓度分别为5 mg/L和10 mg/L，则为T3和T4。4个处理均用液相色谱法准确测定溶液中的TC浓度。

将以上4组处理营养液分别装于玻璃瓶中（瓶外壁涂黑），每瓶溶液体积均为60 mL。把预选出的生长周期一致、生物量接近的3种蔬菜根部分别置于不同TC浓度处理的玻璃瓶中，每瓶1株，小白菜每个处理设4次重复，木耳菜和大白菜每组设3个重复。在不同的设定时刻（t＝1、3、8、24 h）分别取3种蔬菜的不同部位（根、茎、叶）及营养液0.5 mL，植物样品经洗净拭干后称其鲜质量，用于测定TC含量。

植物样品用pH 3.0的蒸馏水研磨，然后超声提取，提取液离心后取上层清液，用自制的前处理装置富集后（MIP特异吸附），以甲醇︰乙酸＝9︰1（V︰V）的混合液洗脱，将洗脱液用N2吹至近干，用甲醇定容至0.1 mL后，用HPLC测定洗脱液中的TC含量（加标回收率为55.22%～85.81%，RSD＝7.52%，n=9，加标浓度10～1 500 μg/kg）；营养液样品过滤后用HPLC测定TC含量。

2 结果与分析

2.1 根际液中TC浓度的变化趋势

分别测定了不同处理时间3种蔬菜根际液中TC的浓度变化情况（图1是T1处理下3种蔬菜根际液中TC浓度变化，其余处理下变化趋势相同）。随处理时间的增加，3种蔬菜根际液TC浓度逐渐降低，小白菜和木耳菜的根际液TC浓度在8～24 h均呈下降趋势，而大白菜的根际液TC浓度在处理8～24 h内趋于稳定，可见不同蔬菜对TC的吸收规律有所不同。

2.2 TC在不同蔬菜根、茎中的含量

图1 3种蔬菜根际液中TC浓度的变化趋势

表1 处理24 h后3种蔬菜根、茎中的TC含量

试验结果表明，3种蔬菜均能吸收累积根外部溶液中的TC。处理24 h后，3种蔬菜体内TC的含量如表1所示。根际暴露24 h后，小白菜根中TC含量在T1和T2处理间有显著性差异，表明根际溶液中TC浓度大小显著影响根中TC的累积，但根际分泌物可以极大减弱这种影响，使得采用根际液配制的T3和T4处理间的小白菜根中TC无显著性差异；小白菜茎中TC含量T1和T2处理间无显著性差异，表明蒸馏水配制的营养液中TC浓度对茎中TC累积无影响，而T4处理茎中TC含量高于T3，且存在显著差异，T2和T4处理的茎中含量间也存在显著性差异，表明根际分泌物有利于TC从根部向地上部迁移。在不同处理间大白菜根中的TC含量变化与小白菜表现出相同的规律，均表现为T2显著高于T1，T3与T4差异不显著，可见大白菜与小白菜的根对TC的累积量受蒸馏水配制的外部营养液中TC浓度影响显著，但不受根际液配制的营养液中TC浓度影响。根外部溶液中TC浓度及溶液条件对木耳菜根、茎中TC含量影响不显著。

2.3 不同时间对TC在蔬菜叶中的含量及累积速率的影响

TC在3种蔬菜叶中的累积速率如表2～4所示。试验结果表明，蔬菜根部能够快速吸收TC并传输至叶片，根际暴露1 h在3种蔬菜叶片中均检出了较高含量的TC，24 h时3种蔬菜叶片中TC的含量大小依次为：木耳菜＞大白菜＞小白菜。3种蔬菜叶片中TC的含量受时间影响较小，使得累积速率不断减小。

如表2所示，随着吸收时间的增长，小白菜叶片中TC含量只有T1变化显著，在8 h时达到最大，显著大于1 h；在根际暴露24 h后，叶片中TC含量4个处理之间无显著性差异，这与其根、茎中TC含量情况有所差异（表1）。小白菜叶片中TC的累积速率随着时间的增加呈下降的趋势，其中T2、T3、T4不同处理时间的累积速率存在显著差异。

如表3所示，在不同处理时间内，木耳菜叶片TC含量T1和T2处理呈先下降（1～3 h，差异不显著）后增加（3～24 h，T1差异不显著，T2差异显著）趋势，T3和T4处理的变化规律不明显；根际暴露24 h时，木耳菜叶片TC含量在同类营养液不同TC浓度处理（T1和T2，T3和T4）之间差异显著，在不同营养液同一TC浓度处理（T1和T3，T2和T4）之间无显著性差异，可见木耳菜对TC的累积量受根际营养液中TC浓度的影响较明显。随着时间的增加，木耳菜叶片中的TC累积速率逐渐下降，不同处理根际暴露1 h时的累积速率均显著大于3、8、24 h，3 h时的累积速率均显著大于8、24 h；而在同一处理时间，营养液中TC浓度越大，木耳菜叶片TC累积速率越大。

如表4所示，根际暴露24 h时，大白菜叶片TC含量在同类营养液不同TC浓度处理（T1和T2，T3和T4）之间、不同营养液同一TC浓度处理（T1和T3，T2和T4）之间均无显著性差异。在不同处理时间内，大白菜叶片中的TC积累速率随时间增加而降低，不同处理根际暴露1 h时的累积速率均显著大于8、24 h，3 h时的累积速率也显著大于8、24 h，而同一处理时间点各处理TC积累速率均无显著性差异。

表2 不同处理时间TC在小白菜叶中的含量和累积速率及其差异性分析

表3 不同处理时间TC在木耳菜叶中的含量和累积速率及其显著性分析

表4 不同处理时间TC在大白菜叶中的含量和累积速率及其显著性分析

3 结论与讨论

试验结果表明，3种蔬菜均能吸收累积根外部溶液中的TC，处理1 h内即能在小白菜、木耳菜和大白菜叶中检出较高含量的TC；TC的吸收与累积效率与植物种类相关，根际暴露24 h后，木耳菜叶中TC含量远大于大白菜和小白菜，这与林琳等[18-19]研究蔬菜对抗生素吸收累积的结果一致。根外部溶液中TC浓度及溶液条件对木耳菜根、茎中TC含量影响不显著。根对TC的累积受根际溶液中TC浓度的影响，但根际分泌物可能减弱这种影响。根际分泌物与微生物相互作用，参与物质循环与能量流动[20]，影响TC在蔬菜中的迁移。

张乙涵等[21]发现水溶液中不同植物对四环素的敏感性频次分布有明显的差异，不同植物的根伸长和芽伸长对四环素生态毒性的敏感顺序均为：根伸长＞芽伸长。本试验处理24 h后，4个处理之间小白菜叶片TC含量无显著性差异，而茎中TC含量T4与其他3个处理存在显著性差异，这与张乙涵[21]等研究不同物种敏感性分布不同的结果一致。根际分泌物在短期内对木耳菜累积TC有一定的影响，可能与植物根系分泌物和根际微生物种群的结构与功能的差异[22]等因素有关。营养液中TC浓度越大，木耳菜叶片对TC的累积速率越大，这与鲍艳宇等[23]的研究成果相似，小麦的根伸长抑制率或芽伸长抑制率与抗生素的浓度之间均存在明显的剂量—效应关系。大白菜叶片TC累积速率随处理时间增加而逐渐降低，可见根际分泌物对大白菜TC累积速率有抑制作用。可是因为根际分泌物与周围环境产生根际效应，影响根际微生物的生态分布、种群组成，进而对植物根系活性表现出促进或抑制作用[23]。

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