改性甲壳素对瘢痕形成影响的动物实验

何君君 ，李天石，朱 辉

（北京大学深圳医院整形外科，广东 深圳 518000）

改性甲壳素对瘢痕形成影响的动物实验

何君君 ，李天石，朱 辉

（北京大学深圳医院整形外科，广东 深圳 518000）

目的通过动物实验，来比较不同浓度的改性甲壳素对创面愈合的影响，探讨是否能够减少瘢痕组织形成。方法实验所用动物SD大鼠120只，随机分成6组，试验浓度设计为（10,100,500,1000,2000,5000）mg/l。制备背双侧对称的全层皮肤缺损模型，自身对照研究；动物模型的一侧创面缺损以不同浓度的改性甲壳素处理，另一侧以每天常规消毒对照研究；于术后7天、14天、21、28天观察记录各组创面参数，进行评价；总结分析改性甲壳素处理创面与对照组大体及组织学形态的差异。结果500 mg/l组、1000 mg/组、2000 mg/组、5000 mg/组中，实验侧vss评分优于对照侧VSS评分，差异有统计学意义（P＜0.01）结论通过动物实验发现，500 mg/l 浓度的改性甲壳素溶液对创面的愈合有明显的促进作用。

改性甲壳素； 瘢痕； 动物实验

甲壳素是一种天然多糖，广泛存在自然界中，在众多领域中有着广泛的应用价值[1]。甲壳素及其衍生物具有良好的生物相容性及生物可降解性，目前已在医药领域广泛应用[2]。目前,有多项研究证明甲壳素能促进伤口愈合、减小瘢痕[3]。本研究分析了改性甲壳素剂量对创面愈合的影响，现报告如下。

1 材料和方法

1.1 实验动物和试剂

1.1.1 实验动物 SD 大鼠，雄性，体重 210 ～220 g，共 120 只购于广东省动物实验中心。

1.1.2 甲壳素材料的选择 本实验选用经过改性后的水溶性甲壳素，脱乙酰度为90%，分子量1-5万单位，样品由深圳市阳光之路科技有限公司提供，除具有非常好的组织相容性外，还具有无毒，无刺激，可降解，无免疫原性，抗菌等化学特性。

1.2 改性甲壳素检验浓度的设置

经过查阅文献后，确定2000mg/l为甲壳素作用的最佳剂量，故试验浓度设计为（10,100,500,1000,2000,5000）mg/l。通过实验进一步验证。

1.3 方 法

采用自身对照法进行比较，在大鼠背部对称性设计2cm×2cm的皮肤缺损模型，采用不同浓度的甲壳素溶液湿敷，对照侧常规碘伏消毒处理。于术后7天、14天、21、28天观察记录各组创面参数，进行评价。

1.4 创面疗效的创有效性分析

创面愈合判定：大体观察，创面上皮组织生长良好，创面完全覆盖，无红肿，无脓性渗出.有效性判断标准：与对照侧配对比较。有效：与对照组比较提前2天以上愈合；无效：与对照组比较提前1天以上愈合、对照组基本相同或推迟愈合。

1.5 瘢痕组织的大体测量

对各组创面的瘢痕按照温哥华瘢痕量表(Vancouverscar scale，VSS)进行量化评分。

1.6 统计学处理方法

采用SPSS.19.0统计软件进行统计分析。每组分别采用配对t检验，以P＜0.01为差异有统计学意义。组间差异暂不分析。

2 结 果

各组创面疗效见表1。各组分别进行配对T检验，10mg/l组、100 mg/l组vss评分差异无统计学意义。500 mg/l组、1000 mg/组、2000 mg/组、2000 mg/组中，实验侧vss评分优于对照侧VSS评分，差异有统计学意义（P＜0.01），见表2。

表1 应用甲壳素后各类创面疗效分析

表2 各组对照侧及实验侧VSS评分均值

3 讨 论

3.1 实验设计

在预实验中，大鼠腹侧制备全层缺损模型中发现，由于大鼠活动影响，腹侧伤口经常受到摩擦，影响创面愈合，故抛弃腹侧制备模型，选用制备大鼠背部双侧对称的全层皮肤缺损模型。由于条件限制，不能做到单个大鼠饲养，分批集中（5只/笼）饲养时，各种原因导致大鼠背侧的创面敷料不能稳妥包扎，我们采用弹性网帽制备大鼠的约束衣,有效的解决了敷料容易掉落的问题.

3.2 改性甲壳素促进创面愈合

减少瘢痕产生的机制瘢痕组织的主要成分是胶原纤维，其中又以Ⅰ型胶原纤维含量最多。在胶原的合成与降解过程中，已经证实有多种生物活性起到重要作用[4]。陈海蓉等使用羟脯氨酸比色法研究羧甲基壳多糖对瘢痕疙瘩成纤维细胞胶原合成的影响，发现羧甲基壳多糖在10、50、100、200ug/ml浓度下对瘢痕成纤维细胞作用48h后,能显著抑制该细胞胶原的合成(P＜ 0.01)[5]。其机制是通过抑制Ⅰ型胶原的产生，从而减少Ⅰ型/Ⅲ型胶原的比例。还有有研究发现，壳聚糖通过刺激多种细胞的生长诱导血管再生和肉芽生成[7]。刘宗军等观察动脉内皮细胞在壳聚糖和磷脂化壳聚糖作用下的增殖和迁移情况，发现内皮细胞在聚糖和磷脂化壳聚糖膜上的增殖率分别达88.8%和77.8%,存活内皮细胞数目较不锈钢片组显著增加(P＜0.01);聚糖和磷脂化壳聚糖膜的细胞迁移数目较空白组显著增加(P＜0.01)，能促进内皮细胞的增殖和迁移[7]。许庆等也发现壳聚糖单体能使内皮细胞在胶原表面形成的管状结构的生成率突增，促进内皮细胞血管化功能[8]。张敬德等用组织块法进行正常皮肤成纤维细胞的体外培养，发现随着甲壳素浓度的增高，成纤维细胞细胞器萎缩，各组G0+G1期的成纤维细胞百分比均上升，S期及G2+M期的成纤维细胞百分比均下降[9-11]。Eugene等通过非晶化蟹壳制备出甲壳素产品 Vinaehitin，用该产品对超过300名重度烧伤、外伤和溃疡患者进行临床使用，其结果表明该产品对伤口愈合有很好的效果。还有研究发现甲壳素可以直接刺激成纤维细胞分泌IL-8来促进伤口中血管内皮细胞的增殖，从而增加血液供应，促进肉芽组织的生长。综上所述，甲壳素通过抑制Ⅰ型胶原纤维的产生、促进内皮细胞的血管化，改善组织修复是的血供，促进创面的愈合，减少瘢痕组织的产生，

本次实验表明，当浓度达到500 mg/l时，改性甲壳素不仅能够促进创面愈合，缩短创面的愈合时间，同时能够减少瘢痕组织产生。说明改性甲壳素疗效安全、可靠，不受环境、条的限制，使用方便，具有很好的使用价值，为临床使用提供依据。同时，当浓度在500 mg/l以上时，不同浓度的溶液对创面恢复的影响，可以进一步研究分析。

[1]董静. 甲壳素/壳聚糖及其衍生物的最新应用进展[J]. 医学综述, 2011, 17(6):921-922.

[2]Jayakumar R, Prabaharan M, Nair S V, et al. Novel chitin and chitosan nanofibers in biomedical applications[J]. Biotechnology Advances, 2010, 28(1):142-150.

[3]王青青，宋超. 甲壳素及其衍生物在医疗领域的应用进展[J].中国临床医药研究杂志 .2008(187)：38-40.

[4]Peters T, Sindrilaru A, Huber R, et al. Overexpression of manganese superoxide dismutase in human dermal fibroblasts enhances the contraction of free floating collagen lattice:implications for ageing and hyperplastic scar formation [J].Archives of Dermatological Research,2009,30(4):273-287.

[5]陈海蓉, 李春霞, 陈西广,等. 羧甲基壳多糖对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和胶原合成的影响[J]. 中华医学美学美容杂志, 2006, 12(3):165-168.

[6]Rosales-Cortés M, Peregrina-Sandoval J, Bañuelos-Pineda J, et al. Immunological study of a chitosan prosthesis in the sciatic nerve regeneration of the axotomized dog[J]. Journal of Biomaterials Applications, 2003, 18(1):15-23.

[7]刘宗军, 孟晟, 秦永文,等. 壳聚糖和磷脂化壳聚糖涂层膜对血管内皮细胞生长和血液相容性的影响[J]. 第二军医大学学报, 2007, 28(1):19-22.

[8]许庆, 陈静, 罗祥林,等. 壳聚糖单体对内皮细胞血管化功能的影响[J]. 中国组织工程研究, 2010, 14(51):9545-9548.

[9]夏平光, 侯春林, 王万宏. 几丁糖抑制人成纤维细胞增殖的实验研究[J]. 中国修复重建外科杂志, 2007, 21(8):833-836.

[10]王亚辉, 张敬德. 几丁糖对增生性瘢痕成纤维细胞的生物学作用[J]. 中国组织工程研究, 2006, 10(32):83-85,插图32-2.

[11]夏平光,侯春林.几丁糖诱导人成纤维细胞凋亡的实验研究[J].解放军医学杂志,2007,32(3):216-217,250.

Animal Experiment of Effect of Modifed Chitin on Scar Formation

HE Jun-jun LI Tian-shi ZHU Hui
(Department of plastic surgery, Shenzhen hospital, Peking University, Guangdong Province,518000, China)

ObjectiveTo compare the effects of different concentrations of modifed chitin on wound healing in animal experiments, and to explore whether it can reduce scar tissue formation.Methods120 SD rats were randomly divided into 6 groups. The experimental concentration was (10,100,500,1000,2000,5000) mg / l. The surface of the animal model was treated with different concentrations of modifed chitin, and the other side was treated with routine disinfection control. The observation and evaluation of the parameters in groups were done at 7,14,21,28 days after operations; summed up the modifed chitin treated wounds and control group in the general and histological differences.ResultsIn the 500 mg/l group, 1000 mg/l group, 2000 mg/l group and 2000 mg /l group, the vss score on the experimental side was superior to the control VSS score, the difference was statistically signifcant (P＜0.01)。ConclusionAnimal experiments found that 500 mg/l concentration of the modifed Chitin solution on the wound healing has a significant role in promoting.

Modifed chitin;scar;animal experiment

2014年度深圳市卫生计生系统科研项目立项编号:201401037。

何君君 ，副主任医师，

李天石，副主任医师。