结核分枝杆菌γ-干扰素体外释放试验在结核感染诊断中的临界值研究

陈振华，余艳艳，王珏，杨希，谭云洪

(湖南省胸科医院检验科，长沙 410013)

·临床检验技术研究·

结核分枝杆菌γ-干扰素体外释放试验在结核感染诊断中的临界值研究

陈振华，余艳艳，王珏，杨希，谭云洪

(湖南省胸科医院检验科，长沙 410013)

目的 探讨结核分枝杆菌γ-干扰素释放试验(IGRAs)在结核分枝杆菌(MTB)感染诊断中的应用价值以及诊断不同年龄MTB感染的最佳临界值。方法 采用回顾性研究。收集574例结核患者和351例结核潜伏感染(LTBI)者作为实验组，337例非结核肺部疾病患者和294例体检健康者作为对照组。采用QFT-GIT试剂盒检测空白对照管(Nil管)、结核抗原管(TB Ag管)和促有丝分裂因子管(Mitogen管)IFN-γ浓度并得出Nil、TB Ag-Nil和Mitogen-Nil，比较分析2组间各检测值差异。按照年龄将纳入分析人群分为中青年组(15～60岁)和老年组(≥61岁)，并分别统计分析TB Ag-Nil差异。ROC曲线分析TB Ag-Nil诊断MTB感染的敏感性、特异性和最佳临界值。结果 Nil在实验组[0.09(0.06，0.14)IU/mL]与对照组[0.08(0.05，0.14)IU/mL]间差异有统计学意义(Z=-3.646，P<0.01)。TB Ag-Nil在实验组[1.16(0.38，3.12)IU/mL]与对照组[0.22(0.13，0.35)IU/mL]间差异有统计学意义(Z=-20.382，P<0.01)；中青年组，TB Ag-Nil在实验组[1.55(0.43，3.64)IU/mL]与对照组[0.22(0.13，0.36)IU/mL]间差异有统计学意义(Z=-17.718，P<0.01)；老年组，TB Ag-Nil在实验组[0.53(0.33，1.47)IU/mL]与对照组[0.20(0.08，0.31)IU/mL]间差异有统计学意义(Z=-10.170，P<0.01)。Mitogen-Nil在2组间比较差异无统计学意义(Z=-0.363，P=0.716)。ROC曲线分析，TB Ag-Nil鉴别中青年MTB感染、老年MTB感染曲线下面积(AUC)分别是0.810和0.792，最佳临界值分别是0.36 IU/mL和0.30 IU/mL，敏感性分别为83.9%和87.7%，特异性分别为75.6%和71.8%。结论 TB Ag-Nil可用于MTB感染辅助诊断，中青年组和老年组最佳临界值略有差异。

γ-干扰素；肺结核；诊断；临界值

结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)γ-干扰素释放试验(interferon-release assays，IGRAs)检测MTB特异性抗原刺激并激活的CD4+和CD8+T细胞产生的IFN-γ，以定性判断是否存在MTB感染[1]。QFT-GIT(Quanti FERON-TB Gold In-Tube)属于IGRAs试剂中的一种，为2007年10月美国食品和药品管理局(FDA)批准使用的第3代全血ELISA方法。国内外学者对QFT-GIT用于诊断MTB感染的敏感性、特异性等指标做了评估，结果差异较大；其性能在我国尚未进行多中心大样本的研究[1-4]。为此，本研究回顾性分析2013年7月至2016年6月间进行QFT-GIT试验的住院患者、结核潜伏感染(latent tuberculosis infection，LTBI)者和体检健康者的体外IFN-γ测定结果，探讨该方法对MTB感染的诊断价值以及适合中国人的最佳临界值。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集2013年7月至2016年6月湖南省胸科医院行IGRAs检测1 556例，其中，574例确诊的结核病患者和351例LTBI者作为实验组，包括男672例，女253例，年龄(52.0±15.2)岁；337例非结核肺部疾病患者和同期检测的294名体检健康者设为对照组，包括男387例，女244例，年龄(51.0±16.6)岁。按照年龄将纳入分析人群分为中青年组(15～60岁)和老年组(≥61岁)。结核病诊断标准：经临床表现、体征、胸部影像学检查、细菌学检查(痰或者支气管肺泡灌洗液涂片抗酸染色或培养)、组织病理学检查、诊断性抗结核治疗达到结核病确诊病例或临床诊断病例标准[5]；LTBI是通过问卷调查得知与活动性结核人群密切接触，无临床症状，胸片X线检查正常，结核菌素试验(PPD试验)阳性；非结核性肺部疾病组包括肺炎192例、慢性阻塞性肺疾病67例、肺癌30例、支气管扩张18例、尘肺16例、肺脓肿10例、肺曲霉病4例。肺癌病例均经组织病理学确诊，其他疾病根据临床症状、体征、常规检验、影像学检查及疗效等证实[6]。所有研究对象均≥15岁、无HIV感染、无糖尿病及免疫抑制剂用药史，女性为非孕期。

1.2 主要试剂及仪器 QFT-GIT试剂盒(澳大利亚Cellestis公司)；PPD(成都生物制品研究所)；HPX-9082MBE恒温培养箱(上海博迅公司)；TD5A离心机(湖南赫西公司)；OS-200振荡器(杭州奥盛公司)；iMark酶联仪(美国Bio-Rad公司)。

1.3 样本采集及血浆IFN-γ浓度检测 根据文献[7]要求，入住本院或体检进行影像学检查和PPD皮试前空腹采集全血，分别取1 mL全血于内含肝素空白对照管(Nil管)、结核抗原管(TB Ag管)和促有丝分裂因子管(Mitogen管)，并立即摇匀。于室温下5 h内送至实验室，37 ℃温育17～19 h，3 000×g离心15 min，分别收集Nil管、TB Ag管和Mitogen管血浆，通过ELISA检测血浆中IFN-γ的释放量。在预包被抗人IFN-γ抗体微孔板中分别加入抗人IFN-γ抗体偶联辣根过氧化物酶(HRP)的酶结合物50 μL，再加入待测血浆样品或标准品各50 μL，室温2 h。洗涤后每孔加入100 μL酶底物溶液，室温30 min。加入50 μL终止液，于波长450 nm处检测吸光度(A)值。以标准品的抗原含量及其对应A值作标准曲线，相关系数>0.98，否则测试无效。根据标准曲线，计算检测样品的IFN-γ浓度。设定Nil管IFN-γ浓度=Nil，TB Ag管减去Nil管IFN-γ浓度=TB Ag-Nil，Mitogen管减去Nil管IFN-γ浓度=Mitogen-Nil。IFN-γ浓度≥10.00 IU/mL的统一按10.00 IU/mL计算。

1.4 统计学分析 用SPSS 20.0软件进行。正态分布的计量资料用均数±标准差表示，非正态分布计量资料采用中位数(四分位数)[M(P25，P75)]表示。IFN-γ浓度比较用Mann-WhitneyU检验；TB Ag-Nil与年龄相关性分析采用Spearman方法。用MedCalc 15软件进行ROC曲线分析，计算曲线下面积(AUC)、最佳诊断界值及其敏感性和特异性。以P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 2组IFN-γ浓度比较 Nil、TB Ag-Nil在实验组与对照组间差异均有统计学意义(Z值分别为-3.646和-20.382，P<0.01)；Mitogen-Nil在2组间差异无统计学意义(Z=-0.363，P=0.716)。见表1。

表1 2组IFN-γ浓度测定结果[M(P25,P75)，IU/mL]

2.2 TB Ag-Nil与年龄相关性分析 实验组TB Ag-Nil水平随年龄增长明显降低，两者呈负相关(r=-0.251，P<0.01)。实验组的中青年患者TB Ag-Nil[1.55(0.43，3.64)IU/mL]明显高于老年患者[0.53(0.33，1.47)IU/mL](Z=-7.823，P<0.01)。对照组TB Ag-Nil变化与年龄无统计学相关(r=-0.067，P=0.094)。

2.3 TB Ag-Nil在中青年组和老年组的结果比较 中青年组和老年组TB Ag-Nil均是实验组高于对照组(Z值分别为-17.718和-10.710，P<0.01)。见表2。

表2 中青/老年实验组与对照组TB Ag-Nil比较[M(P25,P75)]

注：*，与同年龄段实验组比较，P<0.01。

2.4 TB Ag-Nil对MTB感染诊断效能 分别对TB Ag-Nil在整个人群、中青年和老年人群中MTB感染的诊断效能进行ROC曲线分析。AUC分别为0.804(95%CI：0.783～0.823)、0.810(95%CI：0.786～0.832)和0.792(95%CI：0.749～0.831)。TB Ag-Nil在整个人群、中青年和老年人群中诊断MTB感染的最佳诊断界值分别为0.36 IU/mL、0.36 IU/mL和0.30 IU/mL，敏感性分别为78.9%(95%CI：76.1%～81.5%)、83.9%(95%CI：80.9 %～86.5%)和87.7%(95%CI：82.6%～91.7%)，特异性分别为76.4%(95%CI：72.9%～79.6%)、75.6%(95%CI：71.3 %～79.5%)和71.8%(95%CI：64.8%～78.1%)。

3 讨论

QFT-GIT试验盒Nil管是未经任何抗原刺激时的IFN-γ水平，用于阴性对照。本研究发现，实验组Nil高于对照组(Z=-3.646，P<0.01)，可能是MTB感染者血液中较高浓度的嗜异性抗体和非特异IFN-γ引起[8]。Mitogen-Nil反映了机体T淋巴细胞对植物血凝素的免疫应答能力，这与外周血T淋巴细胞的数量和活力有关。按照试剂盒定性结果判读标准，当Mitogen-Nil≥0.5 IU/mL，认为受检者细胞免疫功能“正常”，而且在Nil≤8.0 IU/mL认为本次测定结果“确定”；当Mitogen-Nil<0.5 IU/mL时，可能“不确定”结果。2组Mitogen-Nil比较，差异无统计学意义，提示2组受检者细胞免疫功能无显著差异，Mitogen-Nil不能用于鉴别MTB感染与否。TB Ag抗原管模拟ESAT-6、CFP-10和TB7.7(p4)3种蛋白质的混合多肽刺激体外肝素化全血中的细胞特异产生IFN-γ，TB Ag-Nil为TB特异抗原刺激T淋巴细胞所产生的IFN-γ。本文结果显示，实验组TB Ag-Nil高于对照组，这与吴纯等[9]研究结果一致。

文献报道[4,10]，IFN-γ的释放量与年龄相关，MTB感染者TB Ag-Nil与年龄呈负相关。本研究分别对实验组和对照组TB Ag-Nil与年龄进行相关性分析，实验组TB Ag-Nil与年龄相关系数与卜范峰等[10]结果基本一致。对照组TB Ag-Nil 变化与年龄无相关性。本研究结果显示中青年组TB Ag-Nil明显高于老年组(Z=-7.823，P<0.01)。故本研究将实验组和对照组均按照年龄分为老年组和中青年组，比较结果显示，实验组TB Ag-Nil均高于对照组(P<0.01)。TB Ag-Nil是QFT-GIT试验盒定性判断的重要指标，国内外很多实验室均是以0.35 IU/mL作为折点。但有研究提示，0.35 IU/mL作为折点并不一定适合所有人群[1-2]。本研究中QFT-GIT试验盒TB Ag-Nil对MTB感染诊断效能分析显示，总体最佳临界值是0.36 IU/mL，稍高于试剂盒提供的临界值，这可能与以下原因有关：试剂盒进行临床试验效能评估时，选取的肺结核研究对象是经痰培养(实验室诊断)确诊的，而本研究选取的肺结核研究对象一部分是实验室诊断病例，还有一部分是临床诊断病例；试剂盒临床试验研究对象主要包括美国、日本、丹麦、德国和印度等国家人群，本研究对象主要是中国湖南人群，不同族群之间IFN-γ释放能力也可能不完全一样。通过ROC曲线分析，TB Ag-Nil鉴别中青年MTB感染、老年MTB感染的AUC分别是0.810和0.792，诊断效能均为中等，最佳临界值分别为0.36 IU/mL和0.30 IU/mL，对应的敏感性均大于80.0%，特异性均大于75.0%。由于TB Ag-Nil受被检者淋巴细胞数量、体质指数(body mass index，BMI)、吸烟、高浓度CRP等多因素影响[7,11-12]。本研究未能获得研究对象的上述资料，未能对生物因素对最佳临界值的影响做出分析。综上所述，QFT-GIT试剂盒TB Ag-Nil测定可用于MTB感染的辅助诊断，各实验室需充分探索该技术的性能验证和本室的最佳临界值。

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(本文编辑：周万青，刘群)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.06.10

陈振华，1982年生，男，副主任技师，硕士，从事临床免疫学检验工作。

谭云洪，主任技师，硕士，E-mail：tanyunhong@163.com。

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2017-03-02)