UPLC-QQQ/MS法检测驴胶补血颗粒中的阿胶Δ

陈鸿玉，李劲平，李文莉，丁 野，孙 辉，杨 清，黄晓燕（.湖南省药品检验研究院，长沙 4000；2.中南大学药学院，长沙 4003）

UPLC-QQQ/MS法检测驴胶补血颗粒中的阿胶Δ

陈鸿玉1，2＊，李劲平2#，李文莉1，2，丁 野1，孙 辉1，杨 清1，黄晓燕1（1.湖南省药品检验研究院，长沙 410001；2.中南大学药学院，长沙 410013）

目的：建立驴胶补血颗粒中阿胶的检测方法。方法：采用胰蛋白酶对制剂中阿胶进行酶解，并采用超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用法检测制剂中阿胶成分。色谱条件：色谱柱为HypersilGOLD C18，流动相为0.1%甲酸溶液-乙腈（梯度洗脱），流速为0.3m L/m in，柱温为30℃，进样量为5μL。质谱条件：离子源为电喷雾离子源，离子化模式为电喷雾正离子化模式（多反应监测），检测离子对为阿胶特征分子离子峰m/z 539.8（双电荷）→612.4和m/z 539.8（双电荷）→923.8，喷雾电压为3 100 V，鞘气压为20Arb，辅助气压为8Arb，离子传热管温度为350℃，蒸发温度为350℃，扫描模式为单离子检测扫描，碰撞气体为高纯氩气。结果：阿胶成分检测质量浓度线性范围为20.24～2 024μg/m L（r＝0.997 8）；检测限为1%；精密度、稳定性、重复性试验的RSD＜6.0%。27批样品中均检出阿胶特征分子离子峰。结论：该方法专属性强，可用于驴胶补血颗粒中阿胶的检测。

超高效液相色谱-三重四极杆质谱法；驴胶补血颗粒；阿胶；特征分子离子峰

驴胶补血颗粒为由阿胶、黄芪、党参、熟地黄、白术、当归6味药材组方而成，具有补气养血之功效，临床用于久病气血两虚所致的倦怠乏力、面黄肌瘦、头晕目眩等症的治疗[1]。方中阿胶为君药，阿胶是由马科动物驴的皮熬制而成的胶，具有滋阴补血之功效，为治疗血虚之首选药[2-3]。随着阿胶的需求量日益增大及资源萎缩，致使该药材掺伪造假问题严重，存在使用其他劣质皮类替代驴皮熬制阿胶的违法行为[4-5]。近年来，相关研究针对阿胶药材掺伪造假的问题建立了以特征肽段为指标的专属性检测方法，该方法有效地应用于打击阿胶药材掺伪造假违法行为[6-9]。然而，对于一些阿胶成药掺伪掺假的情况仍缺乏专属性检测方法。本课题组研究的驴胶补血颗粒为2015年版《中国药典》（一部）收载的含阿胶中成药，但现行质量标准中无与阿胶药材相关的检测项目[2]。为了提高该制剂质量标准的专属性和可控性，本课题组采用超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用法（UPLC-QQQ/MS）建立了其中阿胶的专属性检测方法，并进行了方法学验证。

1 材料

1.1 仪器

Dionex UltiMate 3000型 UPLC仪，包括 TSQ Endura QQQ/MS系统（美国Thermo Scientific公司）；CG-300型超声波清洗仪（广州比朗仪器有限公司，功率：300W，频率：25 kHz）；AE240型电子分析天平、XSE205DU型电子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 药品与试剂

驴胶补血颗粒（湖南时代阳光药业股份有限公司，批 号 ：20120410、20120510、20120901、20120921、20121006、20121015、20130145、20130209、20130409、20130507、20130910、20131129、20140312、20140508、20140803、20150215、20150301、20150310，规格：20 g/袋；九芝堂股份有限公司，批号：201306013、201309058、201310033、 201312006、 201403032、 201404019、201405025、201411086、201412014，规格：20 g/袋）；阿胶对照药材（批号：121274-201202）、黄明胶对照药材（批号：121695-201301）、鹿角胶对照药材（批号：121694-201301）均购自中国食品药品检定研究院；猪皮胶对照药材（笔者自制）；胰蛋白酶为质谱级，甲酸、乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 试验条件

2.1.1 色谱条件 色谱柱：HypersilGOLD C18（75mm× 2.1mm，1.8μm）；流动相：0.1%甲酸溶液-乙腈，梯度洗脱（0～6 min，95%→93%A；6～8 min，93%→10%A；8～9 m in，10%A；9～9.5 m in，10%→95%A；9.5～12 min，95%A）；流速：0.3m L/min；柱温：30℃；进样量：5μL。

2.1.2 质谱条件 离子源：电喷雾离子源；离子化模式：电喷雾正离子化模式，进行多反应监测；检测离子对：阿胶特征分子离子峰m/z 539.8（双电荷）→612.4和m/z 539.8（双电荷）→923.8；喷雾电压：3 100 V；鞘气压：20 Arb；辅助气压：8 Arb；离子传热管温度：350℃；蒸发温度：350℃；扫描模式：单离子检测扫描[m/z539.8（双电荷）→612.4，碰撞能量：16 V；m/z 539.8（双电荷）→923.8，碰撞能量：20V]；碰撞气体：高纯氩气。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照药材溶液 称取阿胶对照药材0.1 g，置于350m L量瓶中，加1%碳酸氢钠溶液40m L，超声处理30m in，加1%碳酸氢钠溶液定容，摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液100μL，加胰蛋白酶溶液（取胰蛋白酶，加1%碳酸氢钠溶液使溶解，制成质量浓度为2μg/μL的溶液，临用新配，下同）15μL，摇匀，37℃下恒温酶解8 h，制成阿胶对照药材溶液。同法制成黄明胶、猪皮胶、鹿角胶对照药材溶液。

2.2.2 供试品溶液 取样品适量，研细，称取1 g（约相当于含阿胶0.1 g），置于50m L量瓶中，加1%碳酸氢钠溶液40m L，超声处理30m in，加1%碳酸氢钠溶液定容，摇匀，经0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液100μL，加胰蛋白酶溶液15μL，摇匀，37℃下恒温酶解8 h，即得。

2.2.3 阴性对照溶液 按驴胶补血颗粒处方和工艺制备缺阿胶的阴性样品，并按“2.2.2”项下方法制成阴性对照溶液。

2.3 专属性试验

分别取“2.2”项下对照药材溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各适量，按“2.1”项下试验条件进样测定，记录色谱，详见图1。结果，阴性对照色谱图中，在与阿胶对照药材和供试品相应位置上无相应色谱峰，表明阴性对照对阿胶成分检测无干扰，方法专属性良好。

图1 特征分子离子峰色谱图Fig 1 Characteristicmolecular ion peak chromatograms

2.4 线性关系考察

精密称取阿胶对照药材0.101 2 g，置于50m L量瓶中，加1%碳酸氢钠溶液40m L，超声处理30m in，加1%碳酸氢钠溶液定容，摇匀，作为溶液A。精密量取溶液A 1、2、5、10、20m L，分别置于100m L量瓶中，加1%碳酸氢钠溶液定容，摇匀，经0.22μm微孔滤膜滤过，精密量取续滤液100μL，置于10m L量瓶中，加胰蛋白酶溶液15μL，摇匀，37℃下恒温酶解8 h，制成系列阿胶对照药材溶液。精密量取上述系列阿胶对照药材溶液各5μL，按“2.1”项下试验条件进样测定，记录离子信号相对强度。以阿胶对照药材溶液质量浓度（x，μg/m L）为横坐标、离子信号相对强度（y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程y＝42 810x－5 053.3（r＝0.997 8）。结果表明，阿胶对照药材溶液检测质量浓度线性范围为20.24～2 024μg/m L。

2.5 检测限考察

精密量取“2.2.1”项下阿胶对照药材溶液适量，倍比稀释，并按“2.1”项下试验条件进样测定。当信噪比为3∶1时，得检测限为1%。

2.6 精密度试验

取“2.2.2”项下供试品溶液（批号：20150310）适量，按“2.1”项下试验条件连续进样测定6次，记录离子信号相对强度。结果，m/z539.8（双电荷）→612.4、923.8提取离子流峰保留时间的RSD＝0（n＝6）；m/z 539.8（双电荷）→923.8、m/z539.8（双电荷）→612.4提取离子流峰离子信号相对强度的RSD分别为4.53%、3.47%（n＝6），表明本方法精密度良好。

2.7 稳定性试验

取“2.2.2”项下供试品溶液（批号：20150310）适量，分别于室温下放置0、3、6、9、15、24 h时按“2.1”项下试验条件进样测定，记录离子信号相对强度。结果，m/z 539.8（双电荷）→612.4、923.8提取离子流峰保留时间的RSD＝0.10%（n＝6）；m/z 539.8（双电荷）→923.8、m/z 539.8（双电荷）→612.4提取离子流峰离子信号相对强度的RSD分别为2.97%、5.64%（n＝6），表明供试品溶液室温下放置24 h内基本稳定。

2.8 重复性试验

精密称取同一批样品（批号：20150310）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，共6份，再按“2.1”项下试验条件进样测定，记录离子信号相对强度。结果，m/z539.8（双电荷）→612.4、923.8提取离子流峰保留时间的RSD＝0（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.9 样品检测

取27批样品各适量，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下试验条件进样测定，记录离子信号相对强度。结果，27批样品中均检出阿胶特征分子离子峰。

3 讨论

3.1 色谱条件的选择

在流动相方面，笔者主要考察了乙腈-0.1%甲酸溶液（梯度洗脱）、甲醇-水（梯度洗脱）、乙腈-水（梯度洗脱）、0.1%甲酸-乙腈溶液（梯度洗脱），结果表明，乙腈-0.1%甲酸溶液（梯度洗脱）的分离效果和峰形较好。在柱温方面，笔者考察了柱温为25、30、35℃对色谱分离效果的影响，结果表明，柱温对分离效果和峰形影响不大，本试验选择柱温为30℃。在色谱柱方面，笔者考察了2个品牌的色谱柱，分别是Hypersil GOLD C18（75 mm×2.1 mm，1.8μm）和ACQUITY UPLC BEH C18（50mm×2.1mm，1.7μm），结果前者分离效果较好。

3.2 酶解时间、酶量和酶解温度的考察

笔者参照2015年版《中国药典》（四部）“通则3405肽检查法”中的溶剂条件，考察酶解时间和酶量[10-12]。在37℃恒温水浴中，于酶解8、12、16、20、24 h时分别进样，发现酶解8、12 h时阿胶特征分子离子峰离子信号相对强度一致，因此选择8 h作为酶解时间。将样品和酶比例分别设置为800∶3（m/m）、800∶6（m/m）、800∶9（m/ m），发现当比例为800∶6（m/m）和800∶9（m/m）时，阿胶特征分子离子峰离子信号相对强度一致，考虑尽量降低成本，故选择比例为800∶6（m/m）。酶解温度选择30、37、45℃进行考察，发现37℃时阿胶特征分子离子峰离子信号相对强度最大，故选择酶解温度为37℃。

3.3 提取溶剂pH的考察

提取溶剂分别选择1%碳酸氢钠溶液（甲酸调pH至6.0）、1%碳酸氢钠溶液、1%碳酸氢钠溶液（氨试液调pH至9.0），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别进样。结果，1%碳酸氢钠溶液阿胶特征分子离子峰离子信号相对强度最大。故选择其作为提取溶剂。

3.4 特征分子离子的选择

在本课题组的前期研究中[5-9]，以主成分分析法找出阿胶与龟甲胶、鹿角胶、黄明胶、新阿胶的区别，并通过偏最小二乘法分析找出特征分子离子。故本试验中以m/z 539.8（双电荷）→612.4、923.8为样品中阿胶的特征分子离子。

3.5 耐用性考察

笔者主要考察了UltiMate 3000/TSQ Endura QQQ/ MS仪、API 5500 QQQ/MS仪、Waters I-Class/Xevo TQD QQQ/MS仪。结果表明，3个品牌QQQ/MS仪检测供试品的m/z539.8（双电荷）→923.8和m/z539.8（双电荷）→612.4提取离子流色谱图中，同时出现与阿胶特征分子离子峰保留时间相同的色谱峰，说明本方法的耐用性较好[13-14]。

综上所述，本方法专属性强，可用于驴胶补血颗粒中阿胶的检测。

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Determination of Donkey-hide Gelatin in Lüjiao Buxue Granulesby UPLC-QQQ/MS

CHEN Hongyu1，2，LIJinping2，LIW enli1，2，DING Ye1，SUN Hui1，YANG Qing1，HUANG Xiaoyan1（1.Hunan Provincial Institute for Drug Control，Changsha 410001，China；2.School of Pharmaceutical Sciences，Central South University，Changsha 410013，China）

OBJECTIVE：To establish amethod for the determ ination of donkey-hide gelatin in Lüjiao buxue granules.METHODS：Trypsin was used for enzymatic hydrolysis of donkey-hide gelatin.UPLC-QQQ/MS was adopted for the determ ination of donkey-hide gelatin in the preparation：Hypersil GOLD C18column wasused w ith mobile phase consisted of 0.1%form ic acid solution-acetonitrile（gradient elution）at the flow rate of 0.3 m L/m in.The column temperature was 30℃，and sample size was 5μL. Mass chromatography condition was that ion source was electrospray ion source；ionization mode was ESI+；multiple responsemonitoring was adopted，and characteristic molecular ion peaks of donkey-hide gelatin w ith mass-to-charge ratio of m/z 539.8（double charge）→ 612.4 and m/z 539.8（double charge）→ 923.8 were used as detection ion pair.Spray voltage was 3 100 V；sheath gas was20 Arb；auxiliary gaswas 8 Arb；ion transfer tube temperature was350℃；evaporation temperature was 350℃；scan mode was SRM.Collision gaswas high purity argon.RESULTS：The sample size of donkey-hide gelatin ranged 20.24-2 024μg/m L（r＝0.997 8）.The detection lim it was 1%.RSDs of precision，stability and reproducibility testswere all lower than 6.0%.The characteristic molecular ion peaks of donkey-hide gelatin could be detected in 27 batches of samples.CONCLUSIONS：The method is specific and can be used for the determ ination of donkey-hide gelatin in Lüjiao buxue granules.

UPLC-QQQ/MS；Lüjiao buxue granules；Donkey-hide gelatin；Characteristicmolecular ion peak

R927

A

1001-0408（2017）15-2101-04

2016-06-24

2016-11-05）

（编辑：张 静）

国家科技重大专项课题（No.2014ZX09304307）；湖南省食品药品监督管理局食品药品安全科技项目（No.湘食药科R201504）

＊主管药师。研究方向：药物分析与质量标准。E-mail：649409690@qq.com

#通信作者：副教授，硕士生导师。研究方向：药物分析与质量标准。电话：0731-82650340。E-mail：pjingli@163.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.15.24