喜炎平注射液对腺病毒感染Hep-2细胞Bcl-2/Bax蛋白表达的影响

张秀英, 王雪峰， 王思源， 平静

实验论著

喜炎平注射液对腺病毒感染Hep-2细胞Bcl-2/Bax蛋白表达的影响

张秀英, 王雪峰， 王思源， 平静

目的 观察喜炎平注射液对腺病毒感染Hep-2细胞Bcl-2/Bax蛋白表达的影响，探讨喜炎平注射液体外抗病毒机制。方法 用腺病毒感染Hep-2细胞，分别予喜炎平高、中、低剂量组及利巴韦林干预，采用免疫组织化学法检测各组Hep-2细胞的Bcl-2、Bax蛋白表达情况。结果 模型组Bax蛋白表达显著高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)；喜炎平各剂量组及利巴韦林对照组Bax蛋白表达均低于模型组，其中喜炎平高剂量组、利巴韦林对照组Bax蛋白表达显著低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。各组Bcl-2蛋白表达比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 喜炎平注射液通过抑制Bax蛋白表达的上调发挥体外抗腺病毒的作用，高剂量组优于中低剂量组。

腺病毒； 细胞凋亡； 喜炎平注射液

喜炎平归属于中药注射剂，具有清热解毒，止咳止痢功效，临床上主要用于急性病毒性呼吸道感染、腮腺炎、病毒性肺炎、急性消化道疾病、小儿支气管炎等急慢性病症，且因其显著的抗病毒、抗炎、退热疗效及良好的安全性，在儿科得到广泛使用及一致好评。腺病毒(adenovirus 3，ADV-3)是最常见的引起儿童下呼吸道感染的病毒，报道显示喜炎平注射液体外具有抗ADV的作用[1]，但其机制尚不明确，本研究通过体外实验的方法，探讨喜炎平注射液抗ADV-3感染的作用机制，为临床用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料1.1.1 实验细胞及毒株 喉表皮样癌细胞(Hep-2)细胞株及ADV-3株引自辽宁省疾病预防控制中心，冻存于辽宁中医药大学病毒室。

1.1.2 实验药品及制备 喜炎平注射液(江西清风药业有限公司，批号：20101015)；利巴韦林注射液(郑州羚锐制药股份有限公司，批号：090325i)。

1.1.3 主要试剂及仪器 D-MEM(Gibico公司，批号：1090260)；MEM干粉(Gibico公司，批号：1090260)；MEM液体(HycLone公司，批号：AWG16613)；胎牛血清(Gibico公司，批号：20000122)；青链霉素(华北制药股份有限公司，批号：100225)；谷胺酰胺(上海康达，批号：20011012)；5.6%碳酸氢钠(天津氨基酸公司，批号：050406)；乙二胺四乙酸-胰酶(Gibico公司，批号：20000122)；四甲基偶氮唑蓝(美国Amresco)；二甲基亚枫。

LEIT20MIL型倒置荧光显微镜(德国莱卡公司)；SG403TXC型全外排Ⅱ级生物安全柜(美国Baker公司)；酶标仪(BIORAD公司)；1518TC型CO2培养箱(美国SHEL-LAB公司)；Biofuge 28RS型低温高速离心机(德国Heraeus)。96孔细胞培养板(CeLLstar公司)；24孔细胞板(FaLcon)；凹槽(Costar公司)等。

1.2 方法

1.2.1 Hep-2细胞培养 将长成单层的Hep-2细胞，洗液充分清洗2次，弃去洗液。用0.05%乙二胺四乙酸-胰酶消化后，弃液。10%生长液20 mL吹打贴壁细胞，待细胞均匀悬浮后，至凹槽中。细胞计数，确保Hep-2细胞以5.5×104个/mL的浓度接种于96孔的微量细胞培养板。取96孔的微量细胞培养板，每孔精密吸取细胞悬液100 μL，置于37 ℃、5% CO2培养箱，培养24 h后于倒置显微镜下观察每孔细胞的生长情况。待细胞长成单层的80%以上时，备用。

1.2.2 ADV-3病毒增毒 将病毒原液接种于单层Hep-2细胞上，35 ℃ CO2温箱内吸附2 h，之后补充细胞维持液适量。每日观察，待75%～100%细胞出现病变时，反复冻融2次，置离心管中4 ℃ 12 500 r/min高速离心20 min，离心半径为40 cm，吸取上清液，-80 ℃冷冻保存备用。

1.2.3 ADV-3半数感染量(TCID50)的测定 将增毒后ADV悬液按系列半对数稀释12个浓度，即10-0.5～10-6，分别接种于96孔板单层Hep-2细胞上，每孔100 μL，每个稀释度4个复孔，同时设病毒对照。病毒吸附2 h，之后弃去病毒液，每孔加入100 μL细胞维持液，将其放入35 ℃ 5% CO2温箱内，连续观察结果7 d，同时作正常细胞对照(只加维持液)，并用Reed-Muench公式计算组织细胞培养半数感染量TCID50，实验用病毒攻击量为100TCID50。

1.2.4 细胞分组及干预方法 将细胞分为6组，正常组、模型组、喜炎平高剂量组、喜炎平中剂量组、喜炎平低剂量组及利巴韦林对照组，每组4孔。除正常组外，其余各组每孔加入100 μL 100TCID50的病毒液，35 ℃孵箱中吸附2 h，取出后弃去病毒液，清洗2次。喜炎平高、中、低剂量组(781.25、390.63、195.31 mg/L)及利巴韦林对照组分别给予100 μL/孔药物，继续放入35 ℃ CO2培养箱中培养7 d。1.2.5 喜炎平注射液对Hep-2细胞毒性的测定 将Hep-2细胞以5.5×104个/mL接种至96孔板，待细胞长成单层后，吸弃各孔培养液，将各药物自母液开始按2倍梯度用细胞维持液稀释11个浓度，每个浓度设4孔,每孔100 μL，另设4孔正常细胞对照。35 ℃ 5% CO2培养箱培养72 h，取出以洗液冲洗细胞2遍，每孔加入无血清MEM液90 μL和四氮唑盐溶液10 μL，继续孵育4 h后，终止培养，吸弃各孔培养液，每孔加入二甲亚砜100 μL，选择490 nm波长处测定各孔OD值，计算细胞存活率=药物处理组OD值/正常细胞对照组OD值×100%。

1.2.6 喜炎平对ADV-3感染 Hep-2中Bcl-2、Bax蛋白表达的影响 预先将细胞爬片(4%多聚赖氨酸处理)置于6孔培养板底部，Hep-2细胞经0.25%胰蛋白酶消化后调整细胞密度为2×105个/mL，接种在6孔培养板上，每孔2 mL，置于37 ℃ 5% CO2培养箱中培养24 h。实验组加入不同浓度的喜炎平注射液，阴性对照组加入相同剂量的生理盐水。置于培养箱中继续培养24 h。培养24 h后，取出培养板在倒置显微镜下观察细胞的形态变化并摄片。采用免疫组织化学过氧化酶标记的链霉卵白素(streptavidin peroxidase，SP)法，培养24 h后吸弃培养基，细胞爬片用冰的纯丙酮固定20 min，滴加正常山羊血清封闭非特异性蛋白，滴加一抗工作液孵育，生物素标记的二抗工作液孵育，滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，DAB显色，苏木精染液复染，50%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇梯度脱水，二甲苯溶液透明，中性树胶封固。阳性产物主要在细胞质中表达，呈棕黄色颗粒。采用双盲法随机选择5个高倍镜视野(×400)，染色结果用免疫组织化学积分表示。

2 结果

2.1 喜炎平注射液对Hep-2细胞毒性的测定 经SPSS 16.0软件进行回归Regression的Probity分析，药物浓度与细胞存活率之间存在直线关系，直线方程和相关系数分别为:Y喜炎平=0.705 00-2.130 29X;Y病毒唑=0.114 1-2.517 01X。利巴韦林对照组、喜炎平组半数细胞存活率(TC50)浓度分别为22.05 mg/L、3.021 7 g/L。各组药物对Hep-2细胞的存活率影响，结果见图1。

图1 不同浓度药物对Hep-2细胞的细胞存活率的比较

2.2 不同浓度喜炎平对病毒感染 Hep-2细胞Bcl-2、Bax蛋白表达的影响 模型组Bax蛋白表达显著高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)；喜炎平各剂量组及利巴韦林对照组Bax蛋白表达均低于模型组，其中喜炎平高剂量组、利巴韦林对照组Bax蛋白表达显著低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。各组Bcl-2蛋白表达比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

3 讨论

ADV是一种没有包膜的直径为70～90 nm的颗粒，衣壳里是线状双链DNA分子，相对分子质量为55 000。ADV肺炎是我国发病率较高的病毒性肺炎，多见于6个月至2岁的婴幼儿，临床表现为急骤发热，体温达39 ℃，一般可持续1周以上，病理改变包括支气管炎和肺泡间质炎，严重的肺炎可引起气管、支气管上皮广泛坏死、支气管腔闭塞，妨碍气体交换，导致二氧化碳潴留，使全身代谢过程和重要器官的功能发生障碍[2]，同时有报道显示部分ADV肺炎也引起呼吸系统后遗症[3]。人工自动免疫是一种很好的预防措施，但用作疫苗的某些常用ADV有一定的致癌性，对人有潜在的危险，目前无较理想的疫苗；临床上也有应用化学药物治疗ADV的报道，但结果多不确定，因此探讨有效的治疗药物为临床亟须解决的问题。

表1 不同浓度喜炎平对Bax、Bcl-2蛋白表达的影响±s)

喜炎平注射液是由穿心莲总内酯精炼而成的中成药，其发挥药效的主要成分穿心莲内酯磺化物，研究显示喜炎平多儿童病毒性肺炎有较好的临床疗效[4]，有抗病毒、调节机体免疫等功效[5-6]，同时穿心莲内酯通过占据病毒复制DNA与蛋白质相结合的位置，阻止蛋白质对DNA片段的包裹，使病毒不能完成正常复制，从而达到抑制和消灭病毒的作用[7]，发挥较好的抗病毒疗效。

细胞凋亡是受基因调控的细胞程序化死亡，在细胞凋亡过程中Bcl-2 家族起重要作用，其中Bcl-2和Bax是该家族中最有代表性抗凋亡基因和促凋亡基因，通过形成同源或异源二聚体来调节细胞凋亡[8]。Bcl-2是抑制细胞凋亡的基因，能阻止凋亡的发生；而Bax通过caspase途径激活caspase-3，促进细胞凋亡，两者表达水平高低与直接调控凋亡有关[9]。当Bax蛋白高表达时，Bax/Bax同源二聚体的形成增多，抑制Bcl-2的作用，则促进细胞凋亡；当Bcl-2蛋白高表达时Bcl-2/Bax异源二聚体增多，则抑制细胞凋亡[10]。有研究显示，ADV感染后可导致细胞凋亡[11]。本研究显示模型组Bax蛋白表达显著高于正常组，BaL-2蛋白表达与正常组比较均没有显著差异，说明ADV感染后通过上调Bax蛋白表达促进细胞凋亡。喜炎平各剂量组以及利巴韦林对照组Bax蛋白表达均低于模型组，提示喜炎平可抑制Bax蛋白表达上调，从而阻断细胞凋亡，发挥抗病毒作用。喜炎平高剂量组(781.25 mg/L)、利巴韦林对照组Bax蛋白表达显著低于模型组，说明喜炎平高剂量组(781.25 mg/L)、利巴韦林对照组抗凋亡效果更优。

本研究仅对喜炎平注射液体外抗ADV机制进行了研究，药物进入机体后需要经过一系列的药代动力学过程才发挥其生物学作用，体外实验所表现的明显生物学效应经体内代谢后活性可能会降低或消失，体内药效机制及作用靶点是否与体外结果一致，有待进一步研究。

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(本文编辑：刘颖)

Effect of Xiyanping injection on expression of Bcl-2/Bax protein in adenovirus-infected Hep-2 cells

ZHANGXiuying,WANGXuefeng,WANGSiyuan,PINGJing.
TheFirstAffiliatedHospitalofLiaoningUniversityofTCM,Shenyang110032,China

Objective To explore mechanism of antiviral mechanism of Xiyanping injectioninvitroby invstigating influence of Xiyanping injection on expression of Bcl-2/Bax protein in adenovirus-infected Hep-2 cells.Methods The Hep-2 cells were infected with adenovirus, which were interfered with high, medium and low dose of Xiyanping injection and ribavirin. Then expressions of Bcl-2/Bax protein were measured by immunohistochemistry.Results The expressions of Bax protein in model group were significantly higher than normal groups(P<0.05).The expression of Bax protein in all Xiyangping groups and ribavirin control group was lower than that of model group, and it was much lower in the high-dose Xiyanping group and ribavirin control group than in the model group(P<0.05). The expressions of Bal-2 protein in different groups had no significant difference(P>0.05).Conclusion Xiyanping injection can kill ADV by suppressing the expressions of Bax protein. The high-dose Xiyanping injection is better than others.

Adenovirus; Apoptosis; Xiyanping injection

科技部重大新药创制科技重大专项项目(2011ZX09201-201-04)；十二五重大新药创制专项(2014ZX09201025)

110032 沈阳，辽宁中医药大学附属医院儿科

张秀英(1978-)，女，医学博士，主治医师。研究方向:中医药防治病毒性疾病

王雪峰，E-mail：lnzywxf@163.com

10.3969/j.issn.1674-3865.2017.02.002

R37

A

1674-3865(2017)02-0096-04

2017-03-20)