铁皮石斛种质资源遗传多样性的SRAP分析及指纹图谱构建

李怀志 刘士辉 沈若刚 张中林 黄和喜 王兆龙

摘要[目的] 对铁皮石斛进行有效的遗传多样性分析，对于制订铁皮石斛的保护策略具有重要的意义。[方法]使用25对SRAP引物对供试的石斛进行遗传多样性分析。[结果] 25对SRAP标记共获得86条多态性条带，每对引物组合可扩增出1～6条多态性条带，平均3.07条；20份石斛品系间Jaccard相似系数为0.002～0.821；构建了20份石斛品系的SRAP特征指纹图谱。 [结论]供试的铁皮石斛有较为丰富的遗传变异。

关键词铁皮石斛；SRAP；遗传多样性；指纹图谱

中图分类号S502.4；R282.5文献标识码A文章编号0517-6611（2017）14-0126-03

Abstract[Objective]The genetic diversity of Dendrobium officinale was analyzed，which had the vital significance for formulating conservation strategies for D.officinale.[Method] Twentyfive pairs of SRAP primer combinations were used to evaluate genetic diversity of Dendrobium.[Result] These primer combinations produced 86 polymorphic bands.Each primer pair can produce 1-6 bands，an average of 3.07.Jaccard similarity coefficient among 20 Dendrobium ranged from 0.002 to 0.821. Characteristic fingerprint among 20 Dendrobium was constructed.[Conclusion] There had abundant variation in tested D.officinale.

Key wordsDendrobium officinale；Sequencerelated amplified polymorphism （SRAP）；Genetic diversity；Fingerprint

铁皮石斛（Dendrobium officinale）是兰科石斛兰属多年生附生草本植物，主要分布于浙江、云南、福建、贵州、广东、广西、湖南、江西等地，其干燥茎是我国传统的名贵中药材，具有降低血糖、提高机体免疫、抗癌、抗氧化等作用。近年来，由于过度采挖，加上其苛刻的生长环境，野生的铁皮石斛资源已日渐枯竭。对铁皮石斛进行有效的遗传多样性分析，对于制订铁皮石斛的保护策略具有重要的意义。

相关序列扩增多态性（Sequencerelated amplified polymorphism，SRAP）是一种新型的基于PCR 的标记系统，最早由Li等[1]提出。由于SRAP标记具有操作简便、重复性较好、多态性较高、共显性高等特点而广泛应用在种质资源鉴定、遗传多样性分析、图谱构建、指纹分析及图位克隆等方面[2]。

目前铁皮石斛栽培技术基本成熟，影响产业发展的主要瓶颈是种质混乱、品种退化等问题。大部分种植基地的铁皮石斛群体在形态和颜色上不一致，茎秆颜色有深有浅，有些吃起来有很多渣子。这主要是由于目前应用的种源基本上是野生植株繁殖的，没有经过人工选育，而有些野生植株本身是杂合的，如果进行自花授粉，其后代是分离的，这只有通过人工选育才能解决。对上海孙桥现代农业园的铁皮石斛进行评价有助于理清这些种质的亲缘关系，为以后铁皮石斛间杂交育种提供依据。

1材料与方法

1.1材料供试石斛种质资源来源于安徽、浙江等石斛主要产区。SH-1是金钗石斛（D.nobile Lindl.），SH-2和SH-3是霍山石斛（D.huoshanense），SH-20是金钗石斛与铁皮石斛的杂交种，其余是铁皮石斛（D.officinale）。该试验所用石斛均是组培苗。

1.2基因组DNA提取取植株嫩叶，采用CTAB法提取基因组[3]，以Lambda DNA作为对照，用琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，并稀释至约20 ng/L备用。

1.3PCR扩增引物序列参照表2[1]，由上海生工生物工程服务有限公司合成。SRAP-PCR反应体系总体积为10 μL，其中包括MgCl2 2.0 mmol/L、dNTP各为0.2 mmol/L、引物0.50 μmol/L、模板DNA 50 ng、Taq酶1 U，不足部分用無菌水补足。扩增程序如下：反应混合物94 ℃预变性3 min；94 ℃变性1 min， 35 ℃复性1 min， 72 ℃延伸1 min，5个循环；94 ℃变性1 min， 55 ℃复性1 min， 72 ℃延伸2 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。扩增产物加3 /4体积的上样缓冲液， 94 ℃变性5 min。采用4%的变性聚丙烯酰胺凝胶， 0.5 ×TBE缓冲液，60 W恒功率电泳1.5 h，银染检测电泳结果。

1.4数据分析统计清晰、再现性强的条带。扩增产物按同一位点条带有或无分别赋值，有带记为“1”， 无带记为“0”； 采用NTSYS-pc version 2.10软件计算Jaccard相似系数， 按照UPGMA法进行聚类。

2结果与分析

2.1品种遗传多样性分析 从154对SRAP引物组合中筛选出37对带型清晰、多态性好的引物组合用于遗传多样性研究，选出其中25对引物，扩增出的可重演性的差异条带为86条，扩增片段大小从140～680 bp不等。平均每个引物组合扩增出3.07条多态性条带，其中引物ME8-EM14扩增的多态性条带最多，为6条。品种间Jaccard相似系數为0.002～0.821。20份石斛品系中相似系数最大为0.821（SH-8与SH-12），相似系数最小为0.002（SH-1与SH-4）。

2.2品种聚类分析以0.260为阈值，把20份石斛品系分成4个类群（图1）。第Ⅰ类群为金钗石斛SH-1，第Ⅱ类群为霍山石斛，包含SH-2和SH-3，第Ⅲ类群为金钗石斛与铁皮石斛的杂交种SH-20，第Ⅳ类群为铁皮石斛。从图1中看出金钗石斛与铁皮石斛的杂交种SH-20与霍山石斛聚在一起，与铁皮石斛的亲缘关系较近，与金钗石斛的亲缘关系较远。金钗石斛与铁皮石斛杂交种继承了金钗石斛的高产量，因此市场上经常出现以杂交种冒充铁皮石斛坑害消费者的现象。

2.3品种指纹图谱构建根据每个品种DNA 扩增图谱中SRAP 标记位点条带的有（1）或无（0）进行统计，结果由0和1排列形成字符串，构成一个品种的数字指纹图谱。表3 列出了20份石斛品系的数字指纹图谱。从扩增出的86条特征条带中选择11条谱带把供试20份石斛品系完全区分开，这11条带是由ME8-EM14、ME9-EM3、ME1-EM7、ME1-EM14、ME3-EM3及ME3-EM5这6对引物扩增的。

3结论与讨论

研究表明SRAP技术是研究作物遗传多样性的有效工具。通过对孙桥农业园铁皮石斛遗传多样性分析，理清了石斛间亲缘关系的远近，为防止品种间混杂，并为铁皮石斛间杂交选育提供依据。

丁鸽等[4]利用RAPD标记对不同居群铁皮石斛的遗传多样性进行评价，研究表明铁皮石斛种内多态性水平较高，可达91.35%，用SRAP标记评价不同居群种内多态性水平可达88.01%。包英华等[5]、肖正杭[6]采用SRAP 标记技术扩增8个居群铁皮石斛DNA条带，结果表明从64对SRAP引物组合中筛选出7 对有效引物组合，共扩增出396条清晰谱带，其中多态性条带占382个，总多态性条带比率 99.46%，其铁皮石斛遗传多样性水平比该研究中遗传多样性水平高的原因在于该研究只统计了具有重演性的差异DNA谱带主带。

在铁皮石斛亲缘关系分析上，SSR和SRAP标记对亲缘关系的分类相同，说明SRAP标记在遗传亲缘关系分析上和SSR标记一样有很高的可靠性。

总之，利用SRAP技术对铁皮石斛亲缘关系分析可以揭示石斛不同品系之间的关系远近，并为品种鉴定及育种提供更准确的信息。

参考文献

[1] LI G，QUIROS C F.Sequencerelated amplified polymorphism （SRAP），a new marker system based on a simple PCR reaction：Its application to mapping and gene tagging in Brassica[J].Theor Appl Genet，2001，103（2/3）： 455-461.

[2] 柳李旺，龔义勤，黄浩，等.新型分子标记：SRAP与TRAP及其应用[J].遗传，2004，26（5）： 777-781.

[3] MUTLU N，BOYACI F H，GCMEN M，et al.Development of SRAP，SRAPRGA，RAPD and SCAR markers linked with a Fusarium wilt resistance gene in eggplant[J].Theoretical and applied genetics，2008，117（8）：1303-1312.

[4] 丁鸽，丁小余，沈洁，等.铁皮石斛野生居群遗传多样性的RAPD分析与鉴别[J].药学学报，2005，40（11）：1028-1032.

[5] 包英華，潘超美，白音，等.铁皮石斛种质资源遗传多样性的SRAP分析[J].北京中医药大学学报，2014，37（5）：349-353.

[6] 肖正杭.铁皮石斛种质资源遗传多样性及HPLC指纹图谱分析[D].福州：福建农林大学，2013.安徽农业科学，Journal of Anhui Agri. Sci.2017，45（14）：129-131