紫丁香蘑粗多糖的体外抗氧化活性研究

李男男 李环明 薛春梅 赵永勋 李佳琳 杜春梅 李丽 靖桂云

摘要[目的]研究紫丁香蘑菌丝体粗多糖的抗氧化活性。[方法]采用微波辅助法提取紫丁香蘑菌丝体粗多糖，采用固液分离及离心法提取发酵液粗多糖，采用DPPH法、水杨酸比色法和邻苯三酚自氧化法等研究粗多糖清除自由基能力的变化。[结果]菌丝体粗多糖和发酵液粗多糖均具有较强的抗氧化能力，但2种粗多糖的抗氧化能力有差异；菌丝体粗多糖清除自由基的能力高于发酵液粗多糖，在特定浓度范围内，随着多糖浓度的增加，其抗氧化能力也随之增强，且呈量效依赖关系。[结论]菌丝体粗多糖和发酵液粗多糖均具有抗氧化能力，但菌丝体粗多糖抗氧化能力强于发酵液粗多糖。

关键词紫丁香蘑；粗多糖；抗氧化活性；自由基

中图分类号S646.1文献标识码A文章编号0517-6611（2017）14-0063-03

Abstract[Objective]To study the antioxidant activity of crude polysaccharide in Lepista nuda mycelium.[Method]The mycelium polysaccharide of Lepista nuda was extracted by microwaveassisted method.The crude polysaccharide of fermentation broth was extracted by solidliquid separation and centrifugation.The change in the capacity of crude polysaccharide scavenges free radical with the methods of DPPH，salicylic acid colorimetry and three phenol autoxidation was determined.[Result]The crude polysaccharide of mycelium and fermentation broth both had stronger antioxidant ability.However，the antioxidant capacity of two kinds of crude polysaccharide was different；The ability of scavenging free radical of polysaccharide from mycelium was stronger than that of polysaccharide in fermentation broth.In a certain range of concentration，if the concentration of polysaccharide increased its antioxidant capacity also increased，which was dosedependent.[Conclusion]The crude polysaccharide of mycelium and fermentation broth both had stronger antioxidant ability，and the former was stronger than the latter.

Key wordsLepista nuda；Crude polysaccharide；Antioxidant activity；Free radical

自由基生物學研究与肿瘤发生、心脑血管疾病、药物中毒、人类机体衰老等过程均具有密切的关系，自由基包括超氧阴离子、有机氧自由基、轻自由基、单线态氧、无机和有机过氧化物等类型。正常情况下，生物机体在体内有氧代谢过程中会不断地产生自由基，如果超出机体防御系统所具有的清除能力时，这些自由基会直接地或间接地损伤机体组织，诱发某些疾病的发生[1-2]，因此自由基是机体细胞损伤及其癌变的原始诱发机制之一。部分天然抗氧化剂具有抗氧化物质，能减少对机体的损伤和危害。研究表明，食用菌多糖有效、无毒，具有清除自由基、提高抗氧化酶活性等作用，食用菌多糖将成为新型药物、保健品和抗氧化剂开发和研究的理想来源[3]。

紫丁香蘑（Lepista nuda）属于担子菌亚门（Basidiomveomveotina）层菌纲（Hymenomyeetes）伞菌目（Agaricales）口蘑科（Trieholomataeeae）香蘑属（Lepista），主要分布于我国，欧洲地区也有分布，是一种药食皆用的名贵野生真菌。目前紫丁香蘑菌丝体多糖抗氧化活性的相关研究鲜见报道。笔者以紫丁香蘑液体发酵菌丝体作为材料，研究其清除自由基的能力和活性，以期为其开发和利用此种真菌提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌丝体。紫丁香蘑菌丝体由佳木斯大学微生物实验室提供。

1.1.2培养基。斜面培养基：马铃薯200 g/L，蔗糖20 g/L，KH2PO4 2 g/L，瓊脂20 g/L，MgSO4 1 g/L，VB1 0.01 g/L，pH自然。种子培养基：马铃薯200 g/L，蔗糖20 g/L，KH2PO4 2 g/L，MgSO4 1 g/L，VB1 0.01 g/L，pH自然。液体培养基：马铃薯200 g/L，可溶性淀粉20 g/L，酵母浸粉5 g/L，KH2PO4 3 g/L，MgSO4 0.5 g/L，CaCl2 0.01 g/L，VB1 0.01 g/L，pH 7。

1.2方法

1.2.1培养方法。

1.2.1.1菌种活化。将菌种在28 ℃下培养1 d，无菌条件截取约0.5 cm2接种于试管中，于25 ℃培养，待菌丝长满试管后备用。

1.2.1.2种子培养。选择250 mL三角瓶加入100 mL种子培养基，121 ℃高压灭菌30 min，冷却后，在无菌条件下接种约0.5 cm2的4块至液体培养基中，在25 ℃、110 r/min条件下摇床培养13 d。

1.2.1.3摇瓶培养。将种子悬液接入到指定的液体培养基中，接种量约为5%，并在25 ℃、110 r/min条件下摇床恒温培养13 d。

1.2.2粗多糖样品的制备。发酵产物经固液分离得到菌丝体沉淀和发酵液，菌丝体用蒸馏水洗涤，重复3次，再用滤纸吸至不滴水。所得菌丝体放于50 ℃恒温干燥箱内烘干至恒重，并用天平称重，记录。

称取定量菌丝体按1∶50的比例溶入蒸馏水中，并放入微波炉中，在中火条件下提取15 min，取出后在55 ℃水浴中保温1 h，之后放入低速离心机4 000 r/min离心10 min，沉淀中再加入20 mL蒸馏水，重复上述操作，合并滤液，按1∶5的比例加入95%乙醇，放入4 ℃冰箱醇沉24 h，4 000 r/min离心10 min，沉淀物用无水乙醇、丙酮反复洗涤并干燥，即得到菌丝体粗多糖样品[4-5]。

将发酵液置于离心机中，4 000 r/min离心10 min，沉淀物用无水乙醇、丙酮反复洗涤并干燥，即得到发酵液粗多糖样品。

精确称取菌丝体粗多糖和发酵液粗多糖样品，溶于蒸馏水中，分别配制成0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg/mL的样品溶液。

1.2.3抗氧化活性测定。

1.2.3.1二苯基苦味酰基苯肼（DPPH）法。DPPH清除率测定：精确称取0.015 8 g DPPH试剂，用无水乙醇定容至200.0 mL，使其浓度为200 μmol/L，避光保存。在试管中依次加入原液和8次脱蛋白后多糖水溶液2.5 mL，200 μmol/L DPPH溶液2.5 mL，混匀，25 ℃放置30 min，测定517 nm处的吸光度。以蒸馏水作为空白体系，测定其吸光度，以无水乙醇代替DPPH為对照体系，测其吸光度。每个样品设置3次重复，取其平均值[6]。

清除率=[1-（AS-AT）/AO]×100%

式中，AS为2.5 mL样品液与2.5 mL DPPH试剂混合液的吸光度；AT为无水乙醇代替DPPH作为对照的吸光度；AO为蒸馏水代替样品作为空白的吸光度。

1.2.3.2普鲁士蓝法。还原能力测定：取磷酸缓冲溶液（0.2 mol/L，pH 6.8）和K3Fe（CN）6（1% W/V）各2.5 mL，加入待测液2 mL摇匀后，于50 ℃水浴30 min，然后加入三氯乙酸（10% W/V）2.5 mL，取混合液2.5 mL，与蒸馏水2.5 mL和K3Fe（CN）6（1% W/V）0.5 mL混合后，以磷酸缓冲溶液作为参比，于700 nm处测定吸光度，以蒸馏水作为空白对照。共设置3次重复，取平均值[7]。

1.2.3.3水杨酸比色法。羟自由基清除率的测定：加入9 mmol/L 的FeSO4溶液、水杨酸-乙醇溶液和待测液各1 mL，然后加入9 mmol/L H2O2溶液1 mL，于37 ℃反应30 min，3 000 r/min離心10 min，采用蒸馏水作为对照，在510 nm处测定其吸光度。以FeSO4溶液、水杨酸-乙醇溶液、待测液和蒸馏水各1 mL，测其吸收度。每个样品均设3次重复，取其平均值[8-9]。

清除率=[A0-（Ax-Axo）]/A0×100

式中，A0为空白对照液的吸光度；Ax为加入待测液后的吸光度；Axo为待测液的吸光度。

1.2.3.4邻苯三酚自氧化法。超氧阴离子自由基抑制率测定：取Tris-HCl（0.1mol/L，pH 8.2）缓冲液6 mL于试管中，分别加入各级多糖样品0.5 mL，37 ℃条件下水浴10 min，加入7 mmol/L比邻苯三酚盐酸溶液1 mL，充分混匀，反应4 min，立即用0.5 mL浓盐酸终止反应，测其320 nm处吸光度Ax。对照组以Tris-HCl缓冲液代替糖液作为对照组，测其320 nm处吸光度A0，设3次重复，取其平均值。

抑制率=（ΔA0-ΔAx）/ΔA0×100%

式中，A0为对照液的吸光度在4 min的变化量；Ax为加入提取液后的吸光度在4 min的变化量。

1.3数据处理采用Excel和SPSS 18.0软件对试验数据进行处理，结果取平均数，并进行检验分析。

2结果与分析

2.1DPPH清除率DPPH是一种较为稳定的自由基，易溶于无水乙醇并呈深紫色，当有抗氧化剂存在时，其孤对电子会被配对，表现为紫色减弱，在517 nm处吸收度随之减弱或消失。DPPH法可总体评价天然抗氧化剂消除自由基的能力。由图1可知，2种粗多糖均具有DPPH自由基清除能力，在一定范围内，随着多糖浓度的增加，DPPH自由基清除率也随之增加。菌丝体粗多糖的DPPH自由基清除能力略高于发酵液粗多糖DPPH自由基清除能力，但小于Vc的DPPH自由基清除能力，当浓度为10 mg/mL时，清除率达到最大值，分别为71.44%和52.61%。

2.2还原能力抗氧化剂通过还原作用给出电子来清除自由基，还原力越大抗氧化性越强，可根据还原力的大小来判断其抗氧化活性，其反应生成物在700 nm处的吸光度大小即反映其抗氧化能力的大小，值越大则样品还原能力越强。由图2可知，2种粗多糖均具还原能力，在一定范围内，随着糖浓度的增加，还原能力逐渐加强，菌丝体粗多糖还原能力略高于发酵液粗多糖的还原能力，但与Vc比较，2种糖的还原能力均较弱。当样品液浓度达10 mg/mL时，其吸光度达最大值，分别为0.966和0.493。

2.3羟自由基清除率羟自由基是已知活性最强的自由基，可损伤蛋白质、核酸、脂质等大分子物质，引起细胞损伤，从而导致机体衰老和癌变等。因此，清除羟自由基是预防机体疾病的有效方式之一。由图3可知，2种粗多糖均具有羟自由基清除能力，在一定范围内，随着糖浓度的增加，羟自由基清除率也随之增加，菌丝体粗多糖的羟自由基清除率略高于发酵液粗多糖羟自由基清除率，但低于Vc的羟自由基清除率。当浓度为10 mg/mL时，其清除率达到最大值，分别为81.63%和65.97%。

2.4超氧阴离子清除率超氧阴离子自由基是机体内存在的主要活性氧自由基，对人体的作用具有双重性，其总量较少时，可杀死部分进入机体内的病菌，促进人体机体的健康；当其在机体内大量聚集时，会发生反应并生成氧自由基，引起脂质过氧化，从而导致细胞膜的结构和功能改变，可以通过清除超氧阴离子自由基的能力，来评价其抗氧化能力。由图4可知，2种粗多糖均具有 超氧阴离子自由基清除能力，在一定范围内，随着糖浓度的增加，超氧阴离子自由基清除率也随之增加，菌丝体粗多糖超氧阴离子自由基清除率略高于发酵液粗多糖超氧阴离子自由基清除率，但低于Vc的超氧阴离子羟自由基清除率。当糖浓度为10 mg/mL时，清除率均达最大值，分别为44.83%和31.77%。

3结论与讨论

食用菌多糖具有清除自由基、提高抗氧化酶活性和抑制脂质过氧化等抗氧化活性，可起到保护生物膜和延缓衰老的作用，食用菌多糖可加工成为保健食品和药品，是抗氧化剂

開发的重要来源。该试验结果表明，紫丁香蘑菌丝体粗多糖和发酵液粗多糖均具有清除自由基能力，但发酵液粗多糖清除自由基的能力略弱于菌丝体粗多糖。清除率与多糖浓度具有相关性，即多糖浓度增加，清除率也随之增加，菌丝体粗多糖清除超氧阴离子自由基的能力大于发酵液粗多糖。胞内粗多糖的抗氧化能力强于胞外粗多糖，2类多糖在结构上是否存在差异有待于进一步研究，该试验未对粗多糖成分分离纯化，不能确定哪些成分起到抗氧化活性，这也有待于深入研究。

参考文献

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