六神丸含服对炎性和神经病理性疼痛的治疗作用

陶珊珊++李玉桑

摘要：为探究六神丸含服对炎性和神经病理性疼痛的治疗作用，将90只昆明小鼠，按时间点（1/3 h， 1 h， 6 h）随机分成3组每组分别设模型组、吗啡治疗组（10 mg/kg/d，腹腔注射）、双氯酚酸钠治疗组（15 mg/kg/d；灌胃）、六神丸低高剂量组（2.812 mg/kg/d、14.06 mg/kg/d；含服），于给药1/3 h、1 h、6 h后腹腔注射0.6%醋酸溶液，观察了各组小鼠30 min内的扭体次数.另将15只雄性SD大鼠，给予紫杉醇（8 mg/kg/3d）建立神经病理性疼痛模型并随机均分为模型组、六神丸治疗组，分别在0、2、4、6、12 d后检测了1.875 mg/kg/d六神丸治疗后大鼠的热、冷和机械痛阈值和肝组织H&E染色。结果表明：2.812 mg/kg/d的六神丸能抑制醋酸引起的炎性疼痛，在体内的作用时间持久；1.875 mg/kg/d六神丸含服给药能明显降低紫杉醇导致大鼠的热、冷和机械痛閾值，明显改善紫杉醇导致的大鼠肝脏损伤，减少肝脏炎症。因此少量的六神丸含服有助于缓解炎性疼痛和神经病理性疼痛。

关键词：镇痛；六神丸；神经性病理性疼痛

中图分类号：R285.5

文献标识码：A 文章编号：16749944（2017）10021104

1 引言

六神丸是由牛黄、蟾酥、雄黄、麝香、珍珠和冰片六味中药配制而成的百年传承神药。其具有清热解毒、消肿止痛和敛疮生肌之功效，主要用于烂喉丹痧，喉风乳蛾，咽喉肿痈及痈疽疔疮等症[1]。研究发现灌服大于50 mg/kg的六神丸对二甲苯致小鼠耳廓肿胀有抑制作用，能减轻甲醛致大鼠足跖肿胀；减少醋酸所致小鼠扭体次数，延长扭体潜伏期[2]，对炎性疼痛有很好的治疗作用。药理研究实验室在前期研究中发现低剂量（10 μg/ml）的六神丸有较好的抗癌活性[3]，能有效抑制癌细胞的生存。因此，在综合了大量文献和实验室前期的研究基础上，采用含服给药方式，降低了六神丸的给药剂量，研究了不同给药时间对醋酸引起的炎性疼痛和化疗药物导致的神经病理性疼痛的改善效果，为其临床抗癌镇痛的应用提供科学依据。

2 实验部分

2.1 试剂与仪器

六神丸（上海雷允上公司），双氯芬酸钠、伊红、冰醋酸（Sigma），盐酸吗啡注射液（批号H21022436，东北制药集团沈阳第一制药厂），紫杉醇注射液（批号H10980170，海口市制药厂有限公司），苏木精（南京建成）；。足底测痛仪（美国Ugo Basile），手持式测痛仪（北京硕林苑科技有限公司），铁架台。

SPF级昆明小鼠由湖北省实验动物研究中心提供，体重20～25 g，雄性；SPF级SD大鼠由湖北省实验动物研究中心提供，体重200～250 g，雄性，许可证号SCXK（鄂）2008-0005。

2.2 方法

2.2.1 动物分组

动物的饲养环境为温度22～25℃，湿度30%～40%。小鼠适应性饲养5d后，将90只小鼠按时间点随机分成3大组，每组30只：①1/3 h组；②1 h组；③6 h组；每大组再均分成5个小组，每组6只：①模型组；②吗啡治疗组；③双氯芬酸钠治疗组；④六神丸低剂量治疗组；⑤六神丸高剂量治疗组。大鼠适应性饲养5d后，将15只大鼠随机分成3组，每组5只：①对照组；②模型组；③六神丸治疗组。所有动物实验和处理均遵照“Guide for the Care and Use of Laboratory Animals：实验动物的护理和使用指南”[4]。

2.2.2 动物模型的建立

（1）扭体模型的建立：小鼠进行醋酸致扭体模型的建立，给药后1/3 h、1 h、6 h，动物逐一腹腔注射0.6%醋酸10 mL/kg，观察并记录各组小鼠30 min内的扭体次数。

（2）神经性病理性疼痛的建立：造模开始前分别检测各组大鼠的热痛阈值、机械痛阈值和冷痛阈值，各组大鼠（对照组注射等剂量的生理盐水）注射8 mg/（kg·3d）紫杉醇溶液，诱导神经性病理性疼痛[5]。六神丸治疗组经口含服（将药物放入口腔中，待其在口腔中完全吸收后再放入笼中，并禁食禁水5 h）给予六神丸1.875 mg/（kg·d），其余各组不进行治疗。在造模后2、4、6、12 d检测各组大鼠足趾热痛阈值、冷痛阈值和机械痛阈值。12 d后取各组大鼠的肝脏进行HE染色；

2.2.3 六神丸醇提上清的制备

取六神丸颗粒240粒，置于研钵研成细粉末。将粉末全部转移至50 mL离心管中，加入42 mL无水乙醇进行溶解，放置1 d后得到醇提上清。将醇提上清冻干，保存于干燥器中备用，用时用麻油进行溶解。

2.2.4 醋酸小鼠扭体测试方法

阳性对照组灌胃给予15 mg/kg/d的双氯酚酸钠和腹腔注射10 mg/kg吗啡，六神丸低、高剂量治疗组分别含服给予2.812 mg/（kg·d）、14.06 mg/（kg·d）六神丸，模型组不给药。分别在给药1/3 h、1 h和6 h后，每只小鼠腹腔注射0.6%醋酸10 mL/kg，观察并记录各组小鼠30 min内的扭体次数[9]。抑制率=（对照组平均扭体次数-给药组平均扭体次数）/对照组平均扭体次数× 100%。

2.2.5 热痛阈值的测定

将大鼠置于足底测痛仪相应的格子里，待其安静后，将红外辐射灯移至其足底，开启红外辐射灯，当大鼠感觉到疼痛收缩爪子，此时红外辐射灯熄灭，记录计时器上所显示的时间即为大鼠足底热痛阈值。每只大鼠重复3次，每次至少间隔5 min，取3次实验结果的平均值[6]。

2.2.6 机械痛阈值的测定

用手持式机械测痛仪测量大鼠的机械痛阈值。大鼠固定后，用测痛仪前端的针刺大鼠足底，刺到一定的力度后大鼠缩足，记录此时在测痛仪上显示的值，即为大鼠的机械痛阈值。每只大鼠重复3次，每次至少间隔5 min，取3次实验结果的平均值[7]。

2.2.7 冷痛阈值的测定

采用冷板法测量大鼠的冷痛阈值。将大鼠置于（4±0.5）℃的冷板上，观察并记录大鼠从放上至缩足的时间，即为大鼠的冷痛阈值[8]。

2.2.8 大鼠肝脏H&E染色

大鼠脱颈椎处死后，取其肝脏的最大叶和次大叶置于福尔马林溶液中固定，进行石蜡包埋。切片后进行H&E染色，光镜下观察肝脏病理学变化，并进行肝脏炎性评分[10]。

2.3 统计学处理

数据采用GraphPad Prism 5.0.1科学统计绘图软件分析，数据以x±s表示，组间和组内比较均采用双因素方差分析（Two-way ANOVA），以p< 0.05为差异有统计学意义。

3 结果与讨论

3.1 六神丸抑制醋酸引起的炎性疼痛

六神丸抑制醋酸引起的炎性疼痛结果见图1。如图1所示，阳性组灌服双氯酚酸钠或腹腔注射吗啡1/3 h后，均可见小鼠的扭体次数明显减少，双氯芬酸钠组为（84±6）次，吗啡组为（21±3）次；与模型组进行双氯酚酸钠组（p<0.001）和吗啡组（p<0.001）扭体次数显著降低。低或高剂量的六神丸含服给药也减少了小鼠扭体次数，低剂量六神丸组为（66±6）次，高剂量六神丸组为（69±5）次，低剂量六神丸的扭体抑制率为21.6%。给药1 h后，低剂量的六神丸显现出较有效的镇痛效果（p<0.05）随着给药6 h后，吗啡和双氯酚酸钠的治疗效果减弱，吗啡组为（72±17）次，双氯芬酸钠组为（44±11）次，而低、高剂量六神丸组的效果逐渐增强，低剂量六神丸组的小鼠扭体次数较模型组减少最为明显（p<0.01），为（27±6）次，其扭体抑制率为35.2%。说明六神丸在体内作用时间较持久，低剂量的六神丸含服给药疼痛具有明显的改善作用。

3.2 六神丸抑制紫杉醇引起的神经病理性疼痛

六神丸對紫杉醇引起的神经病理性疼痛的抑制作用结果见图2。腹腔注射紫杉醇造模第2 d后，与空白对照组（热痛：29.0±1.3 s；机械痛：121.3%±16.3%；冷痛：27.8 s±10.8 s）相比，模型组大鼠的足底热痛阈值（11.5 s±1.8 s， p<0.001）、机械痛阈值（68.2%±19.4%， p<0.05）降低最为明显，有显著性的差异；同时六神丸治疗组，大鼠的足底热痛阈值（17.4 s±1.8 s，p< 0.01）明显下降。在腹腔注射紫杉醇造模第12天后，与空白对照组相比，模型组的热痛阈值仍然相对较低（热痛：19.3 s±1.7 s，p< 0.05），六神丸治疗对大鼠的热痛阈值（22.1 s±2.6 s）、机械痛阈值（102.5%±5.2%）以及冷痛阈值（19.2 s±6.1 s）与空白对照组相近，改善作用明显。这说明六神丸含服给药亦能够有效改善化疗紫杉醇引起的神经病理性疼痛反应。如图2所示，腹腔注射紫杉醇造模第2 d后，与空白对照组（热痛：29.0±1.3 s；机械痛：121.3%±16.3%；冷痛：27.8 s±10.8 s）相比，模型组大鼠的足底热痛阈值（11.5 s±1.8 s）、机械痛阈值（68.2%±19.4%）以及冷痛阈值（10.6 s±1.4 s）均下降到最低；而六神丸治疗后，大鼠的足底热痛阈值（17.4 s±1.8 s）、机械痛阈值（74.3%±5.6%）和冷痛阈值（12.6 s±2.2 s）均有不同程度恢复.在腹腔注射紫杉醇造模第12天后，相对于模型组（热痛：19.3 s±1.7 s；机械痛：73.3%±9.5%；冷痛：15.0 s±1.3 s），六神丸治疗对大鼠的热痛阈值（22.1 s±2.6 s）、机械痛阈值（102.5%±5.2%）以及冷痛阈值（19.2 s±6.1 s）改善更为明显。这说明六神丸含服给药亦能够有效改善化疗紫杉醇引起的神经病理性疼痛反应。

3.3 六神丸缓解紫杉醇引起的肝损伤

将大鼠的肝组织石蜡包埋后进行切片，行H&E染色，染色结果如图3所示，图3a中大鼠的肝脏组织结构完整，无明显的肝炎症；而在模型组肝脏中，图3b中可见明显的炎症，在血管周围有大量的炎症浸润，且肝细胞结构不完整；图3c中在血管周围的炎性细胞减少，肝细胞结构相对完整。说明六神丸能够明显的降低肝脏炎症的产生。

各组大鼠的肝组织的炎症评分，即在20倍视野下数炎性灶的个数：0个计0分；1个计1分；2～4个计2分；4个以上计3分，结果见图4。如图4所示，六神丸含服给药能够有效地减少肝脏损伤，缓解化疗药物所引起的炎症（对照组：0.75±0.25；紫杉醇组：2.67±0.33；六神丸治疗组：1.33±0.33），说明六神丸治疗后大鼠的肝组织炎症得到缓解，炎症浸润有明显改善。

4 结论

冰片、雄黄、珍珠六味中药，具有清热解毒、消肿散结的功效，能治疗流行性感冒、急性腮腺炎和冠心病心绞痛等各类炎症疼痛相关疾病[11]。

该实验采用化学刺激造模，腹腔注入醋酸引起前列腺素的释放，诱导产生炎性疼痛，评价六神丸外周镇痛药的效果。马宏跃等[12]灌胃给予六神丸大剂量112 mg/kg，15 min、45 min、1 h后腹腔注射醋酸观察小鼠的扭体抑制率为27.6%， 1 h后药物作用基本减弱至消失，六神丸中抗炎镇痛的主药是蟾酥和牛黄。该实验中小鼠含服给予六神丸2.812，14.06 mg/kg，给药20 min、1 h、6 h后腹腔注射醋酸，低剂量20 min、6 h后的扭体抑制率分别为21.6%和35.2%，镇痛时间更长，剂量更低其六神丸的镇痛主要成分是华蟾毒素[13]。且采取含服给药的方式，避免了肝首过效应，在大大降低给药剂量的同时，获得更好的镇痛效果和延时镇痛的优势。而低剂量的六神丸在体内的作用时间较双氯酚酸钠和吗啡更持久，说明六神丸能有效抑制炎性疼痛，比传统的高剂量多次给药的效果好，为进一步研究抗炎镇痛的活性成分提供了依据。

化疗后疼痛是癌症患者最常发生的后遗症之一，其重要原因是其诱发的外周神经性疾病，临床上常用化疗药如长春碱类、紫杉碱类等均可诱发周围神经病变，发生率从30%～100%[14]，这类疼痛属于神经病理性疼痛的范畴。目前临床上对于这类疼痛的治疗鲜有确切有效的方法。临床研究表明：六神丸配合三阶梯止痛法能治疗癌性疼痛[15]，给予病人一次10粒，每日3次的剂量。在本实验中对大鼠给予六神丸含服一次1粒、每日1次（相当于成人的剂量），发现六神丸能有效的抑制紫杉醇导致的神经病理性疼痛，为进一步研究六神丸治疗癌痛机制提供了依据。苗万等[16]总结六神丸能降低毛细血管通透性，减少炎症渗出，减轻窦道口的充血及肿胀，使巨噬细胞激活，增强其吞噬能力，直接抑制细菌生长并杀伤细胞，产生抗炎、消肿止痛的作用。实验发现六神丸能明显改善肝脏炎症，减少化疗药物引起的肝损伤，说明少量的六神丸可有效缓解神经病理性疼痛，降低化疗药物对肝组织的损伤。

可见少量的六神丸含服给药具有较好抗炎镇痛的作用，能够同时缓解神经病理性疼痛和炎性疼痛，有助于临床化疗药物的配合使用，其详细镇痛的机制仍有待进一步的研究。

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