HPLC法同时测定注射用甲硫氨酸维B1中两组分的含量

陶义华

摘 要：目的：建立一种用HPLC法测定注射用甲硫氨酸维B1中甲硫氨酸和维B1含量的新方法。方法：采用Kromasil氨基键合硅胶柱（250mm×4.6mm；5μm），以（0.02mol·L-1）磷酸二氢钾溶液-乙腈（22：78）为流动相，流速为1.0mL·min-1，检测波长为214nm，以外标法测定。结果：在甲硫氨酸浓度20?g·mL-1～4mg·mL-1范围内，呈良好线性关系（r=1.0000），平均回收率（n=9）为99.7%；在维生素B1浓度2?g·mL-1～0.4mg·mL-1范围内，呈良好线性关系（r=0.9999），平均回收率（n=9）为99.8%。结论：方法快速、简便、准确，结果准确可靠，适用于注射用甲硫氨酸维B1中两组分的含量测定。

关键词：高效液相色谱法 甲硫氨酸 维生素B1 含量测定

注射用甲硫氨酸维B1是一种复方制剂，本品主要成分为甲硫氨酸和维生素B1。其中甲硫氨酸是人体必需氨基酸，但是人体内又无法自行制造，需由饮食摄取。甲硫氨酸能辅助脂肪分解，帮助肝脏脂肪的代谢，预防肝脏及动脉的脂肪堆积，而脂肪会阻碍血流到脑部、心脏及肾脏，还能组成抗脂肪肝形成的化合物⑴。保持血液流顺通畅至肾脏、心脏、大脑等，抵抗人体内脏受到自由基地侵害。维生素B1是人体能量代谢，特别是糖代谢所必需的。当人体的能量主要来源于糖类时，维生素B1的需要量最大。维生素B1还是维持心脏，神经及消化系统正常功能所必需的⑵。

本品能改善肝脏功能，对多数的肝脏疾病，特别是急慢性肝炎、肝硬化，尤其对脂肪肝有特别的疗效；并可用作肝内胆积，酒精、巴比妥类、磺胺类药物中毒时的辅助治疗；还可以清除心脑血管的脂肪，治疗动脉硬化引起的各种疾病，并可作为治疗神经炎和心肌炎的辅助药物。

WS-10001-（HD-1387）-2003甲硫氨酸维B1注射液质量标准⑶中含量测定项下维B1含量为重量法，甲硫氨酸含量为非水滴定法，考虑到实际操作中分别对两组分进行测定，耗时较长，且维B1含量测定法用于定量重现性较差，为保证实际分析中的准确方便，本文采用高效液相色谱法同时测定甲硫氨酸维B1注射液中2种有效成分的含量，所用色谱条件可使2组分分离度符合规定。理论板数按维生素B1峰计算应不低于3000，方法简便，灵敏度高，重现性较好。

1、仪器与试药

Shimadzu LC-10Atvp型高效液相色谱仪及CLASS-VP色谱工作站，METTLER AE240型电子分析天平，维生素B1对照品（中国药品生物制品检定所），甲硫氨酸对照品（购买自晋州冀荣氨基酸有限公司），纯度为99.8%；甲硫氨酸维B1注射液为自制（规格：5mL：甲硫氨酸100mg与维生素B1 10mg）（批号：050604，050605，050603）；磷酸二氢钾为分析纯；乙腈为色谱纯；水为重蒸水。

2、色谱条件

色谱柱：Kromasil氨基键合硅胶柱（250mm×4.6mm；5μm）；流动相：0.02mol·L-1磷酸二氢钾溶液-乙腈（22：78）；流速为1.0mL·min-1，检测波长214nm，进样量10?l。用外标法测定。

3、线性关系

分别精密称取甲硫氨酸及维生素B1对照品各适量，加流动相溶解并制成每1ml中含甲硫氨酸4mg、维生素B1 0.4mg的溶液，作为线性贮备液。精密量取贮备液0.5，5ml分别置100ml量瓶中，另量取2.5，5ml分别置10ml量瓶中，分别加流动相稀释并定容，加上贮备液得到5个线性溶液。取各线性溶液各10?l注入液相色谱仪，记录色谱图。以两次测定的峰面积平均值（A）对对照品浓度（C）进行线性回归，甲硫氨酸、维生素B1回归方程分别为：

A = 7691.1C + 47097 r=0.9998

A= 34581C – 24647 r=0.9999

以上两种成分的浓度分别在20?g·mL-1～4mg·mL-1和2?g·mL-1～0.4mg·mL-1范围内与峰面积呈良好线性关系。

4、稳定性试验

取上述线性关系中甲硫氨酸浓度为2mg·mL-1和维生素B1浓度为0.2mg·mL-1的溶液，在放置0、2、4、8小时测定进样，测定峰面积。甲硫氨酸峰面积的RSD为0.41%，维生素B1峰面积的RSD为0.70%，结果见下表：

结果表明溶液在8小时内稳定。

5、仪器精密度试验

取上述线性关系中甲硫氨酸浓度为2mg·mL-1和维生素B1浓度为0.2mg·mL-1的溶液，重复5次，测定峰面积，甲硫氨酸峰面积的RSD为0.64%，维生素B1峰面积的RSD为0.53%（n=5），表明进样精密度良好。

6、日间精密度试验

取050604批样品5瓶，精密称定内容物，混匀，精密称取适量（约相当于甲硫氨酸100mg），置50mL量瓶中，加流动相稀释并制成每1mL含甲硫氨酸2mg、维生素B1 0.2mg的溶液，平行2份，作为供试品溶液，照样品含量测定项方法分别与第1、2、3、4、5d測定含量，5次测定含量的甲硫氨酸RSD为0.94%，维生素B1 0.78%。

7、回收率试验

精密称取甲硫氨酸80，100，120mg（相当于处方量的80%，100%，120%）各3份，分别精密加入维生素B1 8，10，12mg（相当于处方量的80%，100%，120%）各3份，分别置50mL量瓶中，按照处方比例加入各种辅料，加流动相溶解并稀释至刻度，制成每1mL约含甲硫氨酸1.6，2.0，2.4mg和维生素B1 0.16，0.20，0.24mg的溶液，各精密量取10?l注入液相色谱仪，计算回收率。结果甲硫氨酸、维生素B1高、中、低3个浓度的回收率分别为100.09%、99.30%、99.81%；99.79%、99.55%、100.05%。RSD分别为0.53%、0.97%、1.07%；0.57%、0.73%、0.17%。总的平均回收率（n=9）分别为99.7%，99.8%。

8、重复性试验

精密称取050604批样品适量（约相当于甲硫氨酸100mg），置50mL量瓶中，加流动相溶解并制成每1ml含甲硫氨酸2mg、维生素B1 0.2mg的溶液，平行测定5次含量，甲硫氨酸和维生素B1的平均标示量的百分含量分别为101.3%，100.8%；RSD分别为0.50%，0.42%（n=5）。

9、样品测定

分别取三批样品各5瓶，精密称定内容物，混匀，各精密称取适量（约相当于甲硫氨酸100mg），置50mL量瓶中，加流动相稀释并制成每1mL含甲硫氨酸2mg、维生素B1 0.2mg的溶液，各平行2份，作为供试品溶液，另取甲硫氨酸对照品与维生素B1对照品适量，同法配制成每1mL中约含甲硫氨酸2mg和维生素B1 0.2mg的溶液，作为对照品溶液。各精密量取10?l注入液相色谱仪，记录色谱图；按外标法以峰面积计算，即得。3批样品的含量结果见表1。

10、讨论

10.1 检测波长的选择

我们研制的样品为冻干剂型，为更好的控制产品质量，我们对含量测定方法进行改进。含量测定参考注射用水溶性维生素部版质量标准⑷中维生素B1含量测定的波长214nm，我们对此波长进行验证，分别取甲硫氨酸和维生素B1对照品各适量，加流动相溶解制成每1mL中含甲硫氨酸2mg和维生素B10.2mg的混合溶液，进样，记录色谱图，并由二极管阵列检测器得到2种成分的紫外光谱图（图2），根据两组分的紫外光谱图，考虑到两组分均能有较强的响应，因此确定本品含量测定波长为214nm。从两组分的HPLC图中可看出（图1），甲硫氨酸有较强的响应，峰形良好，维生素B1也有较强的吸收，峰形良好，两组分的分离度大于3.0，柱效均大于5000，系统适用性良好。

10.2 流动相的选择

注射用水溶性维生素部版质量标准中维生素B1含量测定的色谱条件为：[以（0.02mol·L-1）磷酸二氢钾溶液-乙腈（27：73），用10%盐酸溶液调节pH值为5.3的溶液为流动相，经试验此色谱条件甲硫氨酸和维B1未完全分开，分离度小于1.5，调节水相为（0.02 mol·L-1）磷酸二氢钾溶液，不用调节水相的pH值，调节比例为水相：乙腈（22：78），在此条件下甲硫氨酸和维B1分离度大于3.0，两主成分峰形较好，柱效均大于5000（见图1）。

因此确定流动相为：以（0.02 mol·L-1）磷酸二氢钾溶液-乙腈（22：78）。

10.3 方法学考察及实际样品的测定结果显示，本方法操作简便，快捷，结果准确可靠，一次进样即可得到2种成分的含量测定结果，且流动相经济易得，便于在实际生产及检验中使用，提高了工作效率。

參考文献

[1]杨静等，S-腺苷甲硫氨酸的临床及药理研究进展，药学进展，2001，25（3）：164～167.

[2]刘景民等，维生素B1在人体内的作用，实用中西医结合杂志，1995，8（8）：608.

[3]国家药品标准：WS-10001-（HD-1387）-2003甲硫氨酸维B1注射液.

[4]卫生部1996年版药品标准：注射用水溶性维生素质量标准.