雷公藤红素联合顺铂对舌鳞状细胞癌Tca8113细胞作用机制的研究

赖河青

雷公藤红素联合顺铂对舌鳞状细胞癌Tca8113细胞作用机制的研究

赖河青

目的探讨雷公藤红素联合顺铂对舌鳞状细胞癌Tca8113细胞作用机制。方法将Tca8113细胞分为对照组（0μmol/L顺铂和0μg/mL雷公藤红素）、顺铂组（15μmol/L顺铂）、雷公藤红素组（50μg/mL雷公藤红素）以及联合组（15μmol/L顺铂和50μg/mL雷公藤红素），MTT法检测细胞活力，酶联免疫吸附法测定血管内皮生长因子（VEGF）、血管内皮生长因子-C（VEGF-C）、抗凋亡蛋白（Bcl-2）、凋亡蛋白（Bax）水平。结果顺铂组、雷公藤红素组以及联合组Tca8113细胞存活率分别为：（0.61±0.12）%、（0.59±0.12）%、（0.27±0.11）%，顺铂组、雷公藤红素组Tca8113细胞存活率低于对照组的（1.00±0.00）%，差异有统计学意义（P＜0.05），联合组Tca8113细胞存活率低于对照组、顺铂组与雷公藤红素组，差异有统计学意义（P均＜0.05），雷公藤红素组Tca8113细胞存活率低于顺铂组，但差异无统计学意义（P＞0.05）；顺铂组、雷公藤红素组Tca8113细胞VEGF、VEGF-C、Bcl-2水平低于对照组[VEGF：（39.14±1.78）μmol/L、（41.11±1.45）μmol/L比（61.45±2.73）μmol/L，P＜0.05；VEGF-C：（43.11±1.37）μmol/L、（43.13±1.65）μmol/L比（61.33±2.16）μmol/L，P＜0.05；Bcl-2：（52.47±0.98）μmol/L、（53.47±1.03）μmol/L比（78.47±1.33）μmol/L，P＜0.05]，Bax水平高于对照组[（45.14±0.89）μmol/L、（44.14±1.12）μmol/L比（43.14±1.36）μmol/L，P＜0.05）]；联合组VEGF、VEGFC、Bcl-2水平显著低于对照组、顺铂组与雷公藤红素组[VEGF：（23.1±2.13）μmol/L分别与（61.45± 2.73）μmol/L、（39.14±1.78）μmol/L和（41.11±1.45）μmol/L比较，P＜0.05；VEGF-C：（21.45±1.47）μmol/ L分别与（61.33±2.16）μmol/L、（43.11±1.37）μmol/L和（43.13±1.65）μmol/L比较，P＜0.05；Bcl-2：（36.47±1.25）μmol/L分别与（78.47±1.33）μmol/L、（52.47±0.98）μmol/L和（53.47±1.03）μmol/L比较，P＜0.05]；Bax水平高于对照组、顺铂组与雷公藤红素组（79.14±1.45）μmol/L分别与（43.14±1.36）μmol/L、（45.14±0.89）μmol/L和（44.14±1.12）μmol/L比较，P＜0.05]；雷公藤红素组VEGF、VEGF-C、Bcl-2、Bax水平与顺铂组相近，差异无统计学意义（P＞0.05）。结论雷公藤红素联合顺铂对舌鳞状细胞癌Tca8113细胞作用优于顺铂和雷公藤红素单独作用，作用机制可能与其抑制VEGF、VEGFC、Bcl-2表达，促进Bax表达相关。

舌鳞状细胞癌；Tca8113细胞；雷公藤红素；顺铂

口腔鳞状细胞癌（oral squamouscell carcinoma，OSCC）是常见的口腔颌面部恶性肿瘤，约占80%以上，以舌癌发病率最高，舌癌多数为鳞状细胞癌[1]。舌鳞状细胞癌Tca8113细胞能分泌放许多细胞促瘤因子,包括VEGF、VEGF-C等，其中VEGF、VEGF-C在调控肿瘤细胞的生长、增殖、凋亡方面起着至关重要的作用[2-3]。雷公藤红素具有抗癌和抑制癌细胞增生的功能，与抑制肿瘤细胞VEGF、VEGF-C水平[4]，改变Bcl-2、Bax含量有关,而Bcl-2和Bax是对细胞凋亡起重要作用的调控蛋白[5]。顺铂广泛用于各种头颈部恶性肿瘤的治疗，对口腔鳞癌的中度以上敏感率达到89%，其抗癌机制与Bcl-2、Bax相关[6]。近年来，越来越多的药物被联合使用来治疗舌鳞状细胞癌[7]。本研究拟观察雷公藤红素联合顺铂对舌鳞状细胞癌Tca8113细胞的影响，初步探讨其抗癌机制。

1 材料与方法

1.1 研究对象人舌鳞状癌细胞：Tca8113细胞株（中国科学院细胞库，批号YY-XB-A00688）。

1.2 主要试剂及仪器雷公藤红素（99.9%，CAS No：34157-83-0，Sigma公司）；顺铂（99.9%，国药准字H37021358，齐鲁制药有限公司）；VEGF、VEGFC、Bcl-2、Bax Elisa试剂盒（南京森贝伽生物科技有限公司，批号KHG0111、RAB0513-1KT、RAB0757-1KT、CSB-E17114m）；RPMI-1640培养液（Thermo Scientific Forma公司，批号12633-012）；PBS液（武汉博士德公司）；二甲基亚砜（DMSO）（Sigma公司，批号0219605580）；0.25%含EDTA胰酶/胎牛血清（武汉普诺赛生命科技有限公司，批号SV30087.02）。倒置荧光显微镜EclipseE600（Nikon公司）；CO2细胞培养箱Thermo311（Thermo Scientific Forma公司）；恒温培养箱grp-9080（通用公司）；超净工作台ECO 1.5（通用公司）；酶标仪HBS-1096A（通用公司）。

1.3 方法

1.3.1 试剂配制配制雷公藤红素：2%胎牛血清的RPMI-1640完全培养液溶解雷公藤红素母液，调整浓度为50μg/mL，NaHCO3及HCL调整pH至6.6，-20℃冰箱中进行保存。顺铂溶液常规配制。

1.3.2 细胞复苏将装有Tca8113细胞株的冻存管从液氮中取出，37℃水浴箱迅速解冻，无菌吸管吸取菌液至5mL EPP无菌管中，1500r/min，离心5min，上清液吸弃，加进pH值为7.2含10%胎牛血清、链霉素100μg/mL、青霉素100μg/mL的RPMI-1640培养基，直至5mL，37℃、5%CO2培养箱中进行培养传代。

1.3.3 实验分组预试验顺铂组设2.4、6、15、37.5μmol/L 4个浓度梯度（1.5倍间距），时间梯度为24、48、72、96h；雷公藤红素组设31.89、40、50、62.5μg/mL 4个浓度梯度（2.5倍间距），时间梯度为24、48、72、96h，根据预试验结果确定正式试验浓度（见表1）。正式试验对照组设Tca8113细胞组（0μmol/L顺铂和0μg/mL雷公藤红素）、顺铂组（15μmol/L顺铂）、雷公藤红素组（50μg/mL雷公藤红素）以及联合组（15μmol/L顺铂和50μg/mL雷公藤红素），各组细胞浓度分别为1×106个/mL。以上各组每孔设6个复孔，置于37℃、5%CO2培养箱中进行培养72h。

1.3.4 MTT法检测细胞活力在染毒结束以后，每孔加MTT溶液（5mg/ml）10μL，37℃继续孵育4h，吸弃孔内培养上清液。在每孔中加150μL的DMSO,经振荡15min后结晶物充分溶解，利用酶标仪在490nm处波长测定吸光度（A）值，并计算细胞存活率：细胞存活率=（实验组A值-空白组A值）（/对照组A值-空白组A值）×100%。

1.3 ．5VEGF、VEGF-C、Bcl-2、Bax测定染毒结束后，离心培养板收集其上清液，加入PBS制成细胞悬液后，酶联免疫吸附法测定培养液VEGF、VEGF-C、Bcl-2、Bax含量。

1.4 统计学方法Excell 2010、SPSS19.0对数据进行录入、统计分析。VEGF、VEGF-C、Bcl-2、Bax的含量以均数±标准差（x±s） 表示，分析前进行方差齐性及正态检验，若满足正态及方差齐性，采用LSD两两方差分析，若不满足正态及方差齐性，数据转换后再进行LSD两两方差分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 不同浓度顺铂、雷公藤红素在不同时间点对Tca8113细胞存活率的影响当顺铂浓度为15μmol/ L，作用时间为72h时，Tca8113细胞OD值最低；当雷公藤红素浓度为50μg/mL，作用时间为72h时，Tca8113细胞OD值最低；当顺铂、雷公藤红素浓度继续增加，Tca8113细胞OD继续降低。见表1。

表1 不同浓度顺铂、雷公藤红素在不同时间点对Tca8113细胞存活率的影响（x±s）

2.2 顺铂、雷公藤红素对Tca8113细胞存活率的影响联合组、顺铂组、雷公藤红素组Tca8113细胞的存活率明显低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；联合组存活率低于顺铂组与雷公藤红素组，差异有统计学意义（P＜0.05）；雷公藤红素组存活率低于顺铂组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 顺铂、雷公藤红素对Tca8113细胞存活率的影响（x±s）

2.3 顺铂、雷公藤红素对VEGF、VEGF-C、Bcl-2、Bax水平的影响联合组、顺铂组、雷公藤红素组Tca8113细胞VEGF、VEGF-C、Bcl-2水平低于对照组（P均＜0.05），Bax水平高于对照组（P均＜0.05）；联合组VEGF、VEGF-C、Bcl-2低于顺铂组与雷公藤红素组（P均＜0.05），Bax高于顺铂组与雷公藤红素组（P均＜0.05）；雷公藤红素组VEGF、VEGF-C、Bcl-2、Bax水平与顺铂组相近，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

3 讨论

OSCC往往引起组织或器官的残缺，对正常的生理功能及外形产生了非常严重地影响，危及患者生命[8]。因此，对OSCC的研究具有特别重要的意义。研究[9]表明，在多种致瘤因素的共同影响下，正常的组织细胞出现了异常增生，从而形成肿瘤，肿瘤的增殖需要依靠肿瘤外间质组织的支持。许多研究[10]表明，在肿瘤生长过程中，会“激活”其周围的间质，由此就出现了肿瘤的相关间质，反过来它又促进肿瘤的发生与进展。Tca8113细胞能分泌VEGF-C因子和VEGF因子，进而促进肿瘤细胞的生长、增殖以及肿瘤血管和淋巴管形成，从而促进口腔癌的的发展[11]。

研究[12-13]发现，Bcl-2家族蛋白在程序性细胞死亡中起重要作用，Bcl-2基因抑制细胞凋亡，延长细胞的生存而参与肿瘤的发生。Bcl-2蛋白主要分布在线粒体外膜、核膜等处，存在于造血细胞及多种肿瘤细胞中。在Bcl-2转基因小鼠[14]（Transgenic Mice）可发现细胞凋亡（Apoptosis）减少，免疫细胞存活延长从而增加患脓毒症时的生存率。体外实验[15-18]均表明，Bcl-2基因可抑制多种刺激下多种细胞的凋亡。Bcl-2的过度表达可防止射线、糖皮质激素等引起的造血细胞凋亡（Apoptosis），同时也可防止病毒感染后的神经元凋亡。目前认为Bcl-2抗凋亡的机制主要有：（1）阻止细胞色素C激活Caspase；（2）抑制促凋亡蛋白质细胞色素C自线粒体释放到胞质内；（3）对抗促凋亡基因Bax；（4）有抗氧化等作用[17]。

编码的Bax蛋白能与Bcl-2组成异二聚体，对Bcl-2产生抑制作用[18]。研究[19]发现，当Bax表达量较高的时候，能促进细胞凋亡，Bcl-2表达量较高则抑制细胞凋亡，对肿瘤凋亡的发生有重要意义。所以，Bax是非常重要的促细胞凋亡（Apoptosis）基因之一。

表3 顺铂、雷公藤红素对VEGF、VEGF-C、Bcl-2、Bax水平的影响（μmol/L，x±s）

本研究结果发现，单独的顺铂组和雷公藤红素组对Tca8113细胞的作用机制相似，均是抑制VEGF、VEGF-C、Bcl-2的表达，并促进Bax的表达。而在联合组，顺铂和雷公藤红素发生了协同作用，各指标的表达水平均要优于顺铂和雷公藤红素单独作用。

综上所述，雷公藤红素联合顺铂对舌鳞状细胞癌Tca8113细胞的作用优于顺铂和雷公藤红素单独作用，作用机制可能与其抑制VEGF、VEGF-C、Bcl-2的表达，促进Bax的表达相关。

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（收稿：2016-12-16修回：2017-01-20）

Effect of Combination of Tripterine and Cisplatin on Oral Squamous Cell Carcinoma Tca8113 Cells

LAI Heqing.
VIP Ward,Hangzhou Dental Hospital,Hangzhou(310006),China

ObjectiveTo investigate the effect of combination of tripterine and cisplatin on oral squamous cell carcinoma.MethodsTca8113 cells were divided into four groups:control group（0μmol/L cisplatin and 0μg/mL tripterine）,cisplatin group（15μmol/L cisplatin）,tripterine group（50μg/mL tripterine）and combined group（15μmol/L cisplatin and 50μg/mL tripterine）.MTT assay was used to assess cell activity,then ELISA assay was used to detect the protein level of vascular endothelial growth factor（VEGF）,VEGF-C,Bcl-2 and Bax.ResultsThe survival rates of cisplatin group,tripterine group and combination group were 0.61±0.12,0.59±0.12,and 0.27±0.11;the viability of Tca8113 cells in cisplatin group,tripterine group and combined group was significantly lower than that of control group（1.00±0.00,P＜0.05）;the viability in combined group was lower than those in cisplatin group andtripterine group,with a statistical difference（P＜0.05）;no significant difference was found between tripterine group and cisplatin group（P＞0.05）.VEGF,VEGF-C and Bcl-2 protein levels on Tca8113 cells in cisplatin group（39.14±1.78μmol/L,43.11±1.37μmol/L,52.47±0.98μmol/L）,tripterine group（41.11±1.45μmol/L,43.13±1.65μmol/L, 53.47±1.03μmol/L）,and combined group（23.1±2.13μmol/L,21.45±1.47μmol/L,36.47±1.25μmol/L）were lower than those in control group（61.45±2.73μmol/L,61.33±2.16μmol/L,78.47±1.33μmol/L）,but the Bax level in cisplatin group（45.14±0.89μmol/L）,tripterine group（44.14±1.12μmol/L）,and combined group（79.14±1.45）was higher than that in control group（43.14±1.36μmol/L）,with significant differences（P＜0.05）;significant differences were noted between combined group and cisplatin and tripterine groups;but the levels of VEGF,VEGF-C,Bcl-2 and Bax were similar between cisplatin group and tripterine group（P＞0.05）.ConclusionThe combination of tripterine and cisplatin has better curative effects on oral squamous cell carcinoma Tca8113 cells than using these two separately. The underlying mechanism of action may inhibit the expression of VEGF,VEGF-C and Bcl-2,meanwhile promote Bax.

oral squamous cell carcinoma;Tca8113 cell;tripterine;cisplatin

杭州口腔医院总院17楼特需科（杭州310006）