复发性自然流产患者Hcy水平及MTHFR基因多态性与中医肾虚血瘀型相关研究

王晨晔 丁彩飞 杨 欣 万凌屹

复发性自然流产患者Hcy水平及MTHFR基因多态性与中医肾虚血瘀型相关研究

王晨晔 丁彩飞 杨 欣 万凌屹

目的探讨复发性自然流产（RSA）患者同型半胱氨酸（Hcy）水平及MTHFR50名基因突变率与中医肾虚血瘀型相互关系。方法检测50例复发性自然流产患者（RSA观察组）、50名无不良妊娠史的育龄期妇女（健康对照组）血浆Hcy水平、MTHFR基因，中医辨证分为肾虚血瘀型及非肾虚血瘀型。结果RSA观察组MTHFR基因型频率纯合突变型TT（24/50，48%），显著高于健康对照组（9/50，18%）；杂合子型CT（22/50，44%）与健康对照组（24/50，48%）比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；健康对照组野生型CC（17/50，34%）显著高于RSA观察组（4/50，8%）（P＜0.01）；RSA观察组MTHFR基因TT型：肾虚血瘀型（13例，26%）＞非肾虚血瘀型（5例，10%）。复发性自然流产患者MTHFR基因TT型相关性Logistic回归分析显示相关因素中，证型肾虚血瘀型对复发性自然流产患者MTHFR基因TT型影响最大，其他依次为年龄、流产次数。RSA观察组患者血浆Hcy（7.32± 0.79）μmol/L，显著高于健康对照组的（6.10±0.89）μmol/L（P＜0.05）；RSA观察组患者肾虚血瘀证组Hcy水平显著高于非肾虚血瘀型[（7.89±0.76）μmol/L比（6.13±0.96）μmol/L，P＜0.05]。结论MTHFR C677T纯合子突变TT型、Hcy水平增高与复发性流产有明确的相关关系，且与中医肾虚血瘀有相关性。

复发性自然流产；同型半胱氨酸；亚甲基四氢叶酸还原酶；肾虚血瘀

复发性自然流产（recurrent spontaneous abortion，RSA），是指2次或2次以上连续发生的自然流产，发生率为5%[1-2]，排除染色体异常、内分泌异常、免疫因素、感染因素和解剖因素等常见原因，仍有约50%RSA原因不明[3]。研究[4]表明，凝血相关基因亚甲基四氢叶酸还原酶（methylentyahydrofotate reductasa，MTHFR），其C677T位点的突变将导致酶活性降低，且同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）水平升高，可引起胎盘栓塞，从而引发流产。中医认为，肾虚是先兆流产的首要病机。肾虚封藏失职，固摄无权，血海不藏，阴血下漏，血不养胎，胞失肾系则胎元不固；久病瘀血内阻胞脉，恶血不去，新血不得归经，肾虚血瘀，从而导致受孕后阴道下血，腹痛下坠，腰骶酸楚，屡孕屡堕[5]。数堕胎耗气伤血，冲任受损，加之清宫等金器损伤胞络，更加重瘀血形成，因此该病以血瘀为标，肾虚为本。本研究通过对RSA患者与无不良妊娠情况的育龄期妇女Hcy水平及MTHFR基因进行检测，研究复发性自然流产与Hcy水平及MTHFR基因突变率的相关性，及其两者与中医肾虚血瘀型及非肾虚血瘀型相互关系；为临床采用“补肾活血法”治疗RSA高Hcy水平及MTHFR基因突变引起的血栓前状态提供理论依据。

1 临床资料

1.1 一般资料2015年3月—2016年4月本院生殖科收治符合不明原因复发性流产纳入标准[6]的复发性流产患者50例为RSA观察组，平均年龄（31.56±4.82）岁，平均体质量（56.67±5.84）kg；拟行孕前检查的无不良妊娠史的育龄期健康妇女50名为健康对照组，平均年龄（32.12±3.98）岁，平均体质量（57.21±4.63）kg。两组受试者年龄、体质量差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 诊断标准参照《现代妇产科进展——复发性流产的诊断和治疗》[7]，及与同一性伴侣连续遭遇2次或2次以上在妊娠20周前的胎儿（体质量≤500g）丢失。

1.3 纳入标准RSA观察组：（1）夫妇双方外周血染色体核型正常，无家族遗传病史；（2）经检查排除生殖系统解剖畸形；（3）内分泌功能正常；（4）TORCH检测阴性；（5）抗心凝脂抗体检测阴性；（6）抗精子抗体（AsAb）检测阴性；（7）夫妇ABO血型抗体系统检测IgG抗A抗体、IgG抗B抗体滴度低于1∶64，RH因子阳性。（8）尿HCG阴性。健康对照组：为孕前检查的育龄期健康妇女，无自然流产史，无不良生产史，尿HCG阴性。

1.4 排除标准（1）合并器质性疾病，如心血管、肝、肾和造血系统等严重原发性疾病者；（2）存在染色体异常、解剖结构异常、内分泌失调、生殖道感染、自身免疫性疾病等病因者；（3）精神病患者；（4）资料不全无法判断结果者；（5）尿HCG阳性者。

2 方法

2.1 观察指标

2.1.1 MTHFR基因C677T多态性检测PCR反应：RT-PCR试剂与引物合成（武汉博士得生物工程有限公司），总蛋白提取试剂盒（SBS Cenetech公司），PCR仪（德国Biometra公司）；MTHFR：C677T引物序列，上游：5'－TGAAGGAGAAGGTGTGTGCGGGA－3'，下游：5'－AGGAGGGTGGGGTGAGAGTG－3'。PCR扩增循环条件：91℃预变性和变性各2min，56℃退火1min、74℃45s 30个循环、72℃5min、4℃12h，cDNA产物置于-20℃保存。3%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物进行分析。具体试验操作由我院中心试验室完成。

2.1.2 血浆同型半胱氨酸测定研究对象于早晨空腹采集静脉血2mL，EDTA—K3（乙二胺四乙酸三钾）抗凝，1h内送本院检验科，采用高效液相色谱法测定完成。

2.2 中医辨证分型由我院两位以上主治中医师根据患者的症状、体征、舌苔、脉象，四诊合参，根据中医证候诊断标准：参照《中药新药临床研究指导原则》、《中医妇科临床研究》有关内容拟定分为肾虚血瘀型与非肾虚血瘀型[8-9]。所有辨证符合主症兼具次症中任一项结合舌质脉象，即可诊断。肾虚血瘀型：主症：腰膝酸软；次症：（1）头晕耳鸣；（2）面色晦暗；（3）既往月经量少或有血块；（4）夜尿频数；（5）潮热盗汗或畏寒肢冷；（6）眼睑轻微浮肿；（7）性欲减退；舌脉：舌淡苔白或舌质紫暗，舌边有瘀点或瘀斑，脉沉细滑或涩或尺脉弱。除肾虚血瘀型之外均为非肾虚血瘀型。

2.3 统计学方法应用SPSS17.0软件，计量资料以（x±s） 表示，采用t检验，计数资料采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。年龄、流产次数、证型（肾虚血瘀型和非肾虚血瘀型）与MTHFR突变基因TT型的交互作用，采用多元Logistic回归进行分析。

3 结果

3.1 两组3种MTHFR基因型频率分析RSA观察组纯合突变型TT、杂合子型CT、野生型CC分别为24例（48%）、22例（44%）、4例（8%），健康对照组分别为9例（18%）、24例（48%）、17例（34%）。两组杂合子型CT频率数差异无统计学意义（P＞0.05），RSA观察组纯合突变型TT、野生型CC频率与健康对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。

3.2 两组3种MTHFR基因型与中医辨证RSA观察组肾虚血瘀型比例高于健康对照组（P＜0.01）；RSA观察组50例中肾虚血瘀型MTHFR基因TT型比例显著高于非肾虚血瘀型，见表1。

表1 RSA患者与健康对照者MTHFR基因型（TT、CT、CC）与中医辨证（例）

3.3 复发性自然流产患者MTHFR基因TT型相关性Logistic回归分析Logistic回归分析表明，3个相关因素中肾虚血瘀型对RAS患者MTHFR基因TT型影响最大，其他依次为年龄、流产次数，见表2。

表2 RSA患者MTHFR基因TT型相关性logistic回归分析

3.4 两组血浆同型半胱氨酸水平测定RSA观察组血浆同型半胱氨酸水平为（7.32±0.79）μmol/L，高于健康对照组的（6.10±0.89）μmol/L（P＜0.05）；RSA肾虚血瘀型患者血浆Hcy水平高于非肾虚血瘀型患者（P＜0.05），见表3。

4讨论

导致流产的原因除免疫疾病、内分泌异常、组织感染、生物遗传及生殖道畸形等疾病外，约有50%患者病因不明，称为不明原因复发性自然流产（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）[10]。亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）是甲硫氨酸－叶酸代谢中的一个关键酶，人MTHFR基因目前已经发现20余种该基因的突变，其中最常见的是C677T点突变，造成碱基T替换了C，其编码的氨基酸也由缬氨酸代替了丙氨酸，突变可直接影响酶的活性和耐热性，从而导致同型半胱氨酸的转硫基和甲基化过程出现障碍，使MTHFR的活性减弱，造成叶酸水平降低及高同型半胱氨酸血症（HHcy）。妊娠期高同型半胱氨酸血症可致血液呈高凝状态，增加胎盘栓塞危险，可能是复发性流产（recurrent spontaneous abortion，RSA）的发生机制[11]。高Hcy血症还可能引起绒毛膜绒毛血管化不良，造成胚胎死亡，导致流产[12]，另外由于胎盘组织MTHFR活力缺乏，致使作为甲基间接供体的5－甲基四氢叶酸生成障碍，进一步影响嘧啶、嘌呤和核酸的代谢及DNA甲基化，使得胎儿发育必需的生物成分包括DNA和蛋白质的甲基化不足，是导致RSA的另一个可能原因[13]。

表3 RSA血浆同型半胱氨酸水平与中医辨证分型的关系（μmol/L，x±s）

复发性流产属中医“滑胎”范畴。其发病机制为母体冲任不固及胎元不健，病因病机多为肾虚，气血虚弱，血热及血瘀，且多责之于肾。肾为先天之本，主生殖，且胞脉者系于肾，若母体肾虚，则胎失所系，导致胎动不安，甚则屡孕屡坠。反复流产可伤及冲任胞络，导致瘀血滞留胞中，再孕后又因精血聚于下以养胎，汇聚之精血又增加气血运行阻力，进而又加剧了瘀血形成，瘀血不去，有碍新血归经，不能养胎，最后致胎元不固而流产。肾虚血瘀贯穿复发性流产的全过程[5]。

本研究发现，RAS患者MTHFR基因型的分布频率，TT型显著高于健康对照组；RAS患者CT型与健康对照组比较，无显著性差异；健康对照组CC型显著高于RAS组；提示MTHFR基因型中TT型与RAS密切相关。RAS患者肾虚血瘀型比例显著高于健康对照组，提示肾虚血瘀可能是复发性流产的基本病机之一。同时发现，复发性自然流产组MTHFR基因TT型肾虚血瘀型患者数＞非肾虚血瘀型患者数。复发性自然流产MTHFR基因TT型相关性Logistic回归分析表明，3个相关因素中，肾虚血瘀型对RAS患者MTHFR基因TT型影响最大，其他依次为年龄、流产次数；提示RAS患者MTHFR基因型中TT型与肾虚血瘀密切相关。研究还显示，RAS患者血浆同型半胱氨酸水平（Hcy）显著高于健康对照组（P＜0.05），其中RAS肾虚血瘀型患者Hcy水平显著高于非肾虚血瘀型患者。提示RAS与Hcy水平升高有相关性，Hcy水平与中医肾虚血瘀亦存在一定相关性。

本研究结果显示，肾虚血瘀型RAS患者MTHFR基因TT突变频率、Hcy血症均高于非肾虚血瘀型患者，肾虚血瘀可能是其发生发展的基本病机，推测补肾活血法可能成为孕前甚至孕期治疗RSA伴MTHFR基因TT突变及高Hcy者的中医治法，但临床还应结合患者的具体症情进行辨证施治，在补肾活血基础上，兼以补气、健脾、滋阴、养血、凉血等不同治法，结合患者的个体情况综合治疗，才能进一步提高临床疗效。

（本文受到浙江省中西医结合医院科研基金资助No.hhyn201501）

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（收稿：2016-05-15修回：2016-12-28）

Relationship between Hcy Levels and the Polymorphism of MTHFR Gene with TCM Type of Kidney Defi－ciency and Blood Stasis in Recurrent Spontaneous Abortion Patients

WANG Chenye,DING Caifei,YANG Xin,WAN Lingyi.
Department of Reproductive Medicine,Integrated Chinese and Western Medicine Hospital of Zhejiang Province,Hangzhou(310003),China

ObjectiveTo investigate the relationship between homocysteine（Hcy）level and MTHFR mutation rate with TCM Kidney Deficiency and Blood Stasis Type in natural recurrent spontaneous abortion patients.MethodsThe level of Hcy and MTHFR gene in 50 recurrent spontaneous abortion patients（observation group）and 50 child-bearing-age women without adverse pregnancy history（control group）were detected.TCM differentiation included kidney deficiency and blood stasis type and non-kidney deficiency and blood stasis type.ResultsTwenty-four out of 50 patients in observation group and 9 women in control group had the TT genotype of MTHFR C677T（48%vs 18%,P＜0.05）;22 patients in observation group and 24 women in control group had the CT genotype（44%vs 48%,P＞0.05）;17 women in control group and 4 patients in observation group had the CC genotype（34%vs 8%,P＜0.05）.Logistic regression analysis result showed that the TT genotype of MTHFR gene played the most important role in the TCM differentiation of kidney deficiency and blood stasis type and non-kidney deficiency and blood stasis type in recurrent spontaneous abortionpatients,followed by age and the number of abortions. The serum level of Hcy in observation group was significantly higher than that in control group（7.32±0.79μmol/L vs 6.10±0.89μmol/L,P＜0.05）;in observation group,the Hcy level of patients with kidney deficiency and blood stasis type was significantly higher than that of patients with non-kidney deficiency and blood stasis type（7.89± 0.76μmol/L vs 6.13±0.96μmol/L,P＜0.05）.ConclusionMTHFR C677T TT homozygous mutant types,the increase of Hcy level and recurrent miscarriage have a clear correlation and are also correlated with the TCM KidneyBlood.

recurrent spontaneous abortion;homocysteine;methylenetetrahydrofolate reductase;kidney deficiency and blood stasis

浙江省中西结合医院生殖医学科（杭州310003）

丁彩飞，Tel：13588810881