重组人可溶性Tim-3原核表达载体的构建及其重组蛋白的优化表达*

白少云， 卿吉琳， 刘 振， 谭源福△， 陈治中

1广西医科大学第一附属医院神经外科，南宁 530021 广西壮族自治区人民医院 2妇产科 3检验科，南宁 530021

重组人可溶性Tim-3原核表达载体的构建及其重组蛋白的优化表达*

白少云1， 卿吉琳2， 刘 振1， 谭源福1△， 陈治中3△

1广西医科大学第一附属医院神经外科，南宁 530021 广西壮族自治区人民医院2妇产科3检验科，南宁 530021

目的 构建人可溶性Tim-3(sTim-3)的重组质粒表达载体pET28a-sTim-3-EGFP，在大肠埃希菌中进行诱导表达并对其表达条件进行优化。方法 取健康人外周血提取总RNA，RT-PCR扩增Tim-3基因胞外段序列，克隆入已构建的表达载体pET28a-EGFP中，鉴定阳性克隆。重组质粒转化BL21(DE3)，通过调整IPTG浓度、诱导时机、诱导温度与诱导时间优化蛋白表达条件。结果 成功构建原核表达载体pET28a-sTim-3-EGFP，并转化BL21(DE3)进行诱导表达。温度和IPTG浓度对蛋白表达量影响不大；在培养至A600 nm值约为0.6～0.8时于25℃诱导5 h可获得较高的蛋白表达。结论 成功表达可溶性重组蛋白sTim-3-EGFP，为该蛋白的进一步纯化生产及应用奠定了良好基础。

Tim-3； 原核表达； 增强绿色荧光蛋白; 融合蛋白

T细胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域家族(T cell immunoglobulin and mucin-domain containing molecules family，TIM)是2001年McIntire等[1]在研究过敏和哮喘基因过程中发现并定位克隆的一个新的基因家族。该家族共包括8个成员(Tim-1～Tim-8)，其中仅Tim-1、Tim-3、Tim-4存在于人类，定位于与过敏、哮喘和自身免疫性疾病相关的人类5号染色体5q33.2上。全长人Tim-3蛋白共由301个氨基酸组成，其结构从N端到C端分别由信号肽、IgV亚单位、黏蛋白样结构域、单跨膜结构域和富含Tyr的胞质尾区组成[2]。Tim-3蛋白是Ⅰ型膜蛋白，其基因序列的信号肽区多肽在其成为有功能的蛋白分子前已被剪切去除，IgV亚单位和黏蛋白样结构域构成的胞外部分为其发挥功能的重要区域，参与配体的识别和结合。先前的研究在小鼠体内发现了缺乏黏蛋白样结构域和跨膜区的Tim-3的可溶性形式[3]；近些年在人体内也发现了Tim-3的可溶形式，是由金属蛋白酶ADAM10和ADAM17将全长膜型Tim-3在细胞膜表面裂解产生，其仅由IgV亚单位和黏蛋白样结构域组成[4]。

2002年Monney等[5]首先报道了Tim-3主要表达于产γ干扰素(IFN-γ)的CD4+T辅助细胞1(Th1)和CD8+细胞毒性T细胞(Tcl)表面。随后在Th17细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等其他免疫细胞表面也相继发现了Tim-3的表达[6-7]。半乳糖凝集素-9(galectin-9，Gal-9)是Tim-3的天然配体，可与Th1和Th17细胞表面的Tim-3分子特异性结合负性调节Th1和Th17细胞的免疫功能[8]。随后又确认磷脂酰丝氨酸(phosphatidyl serine，PtdSer)、高迁移率组蛋白B1(HMGB1)、Ceacam-1等为Tim-3的其他几种配体，其中一些主要在固有免疫细胞中发挥作用。功能研究显示Tim-3是一种具有多种生物学功能的免疫调节分子，在哮喘、自身免疫性疾病、过敏性疾病、器官移植、病毒感染、不明原因习惯性流产及肿瘤等多种疾病的免疫调节中具有重要作用，且在免疫调节的不同阶段发挥的作用有所不同[6]。在肿瘤组织中，高表达Tim-3往往提示预后不良，因而Tim-3有望作为肿瘤免疫治疗的新靶点。

本研究应用基因工程技术，将Tim-3胞外段基因与增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)重组到原核表达载体，并诱导其初步表达产生sTim-3-EGFP融合蛋白，为sTim-3的后续研究及临床应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

逆转录试剂盒、TaqDNA聚合酶、限制性内切酶NocⅠ和SacⅠ、250 bp DNA Ladder marker、1 kb DNA ladder marker及pMD18-T载体购自TaKaRa公司。质粒提取试剂盒、DNA纯化回收试剂盒、T4DNA连接酶、HRP标记羊抗小鼠二抗、感受态大肠埃希菌DH5α和BL21(DE3)均购自天根生化科技(北京)有限公司。卡那霉素、氨苄西林购自上海生工生物技术公司。人外周血淋巴细胞分离液、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopro-pyl-β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)购自索莱宝公司。蛋白预染Marker购自Thermo公司。小鼠抗His标签单抗、小鼠抗EGFP标签单抗购自Origene公司。Trizol试剂购自Invitrogen公司。pET28a原核表达载体及已构建好的pET28a-EGFP重组质粒[9]由本实验室保存。其他试剂为国产分析纯。

1.2 Tim-3胞外段RT-PCR引物的设计

在GenBank中查找到Tim-3基因编码序列，结合跨膜预测软件如TMHMM Server v.2.0、TMpred、TMAP等预测胞外段序列，自行设计引物。上游引物：5′-CATGCCATGGATATGTTTTCACATCTTCCCTTTGAC-3′，下游引物：5′-GCG-AGCTCTCTGATGGTTGCTCCAGAGTCC-3′，划线部分分别为NcoⅠ和SacⅠ酶切位点，引物由上海生工生物技术公司合成。

1.3 RNA提取、RT-PCR扩增Tim-3胞外段及产物的克隆测序

分离人外周血单个核细胞，根据Trizol试剂说明书从单个核细胞中提取总RNA。将获得的RNA进行RT-PCR，产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定后用DNA回收试剂盒纯化PCR产物。产物与pMD18-T载体(TaKaRa公司)连接转化感受态大肠埃希菌DH5α，氨苄西林(Amp)筛选阳性克隆，进行菌液PCR、提取质粒双酶切鉴定，后选取阳性克隆菌液送上海生工生物技术公司测序。其中PCR扩增反应条件为：先95 ℃预变性5 min；后94 ℃变性30 s，60 ℃退火45 s，72℃延伸45 s进行30个循环；最后72℃延伸5 min。

1.4 pET28a-sTim-3-EGFP重组质粒表达载体的构建

提取测序正确的质粒，行NcoⅠ和SacⅠ双酶切，同时对本实验室已构建保存的pET28a-EGFP重组质粒经相同的内切酶双酶切，琼脂糖凝胶电泳和DNA纯化回收后进行连接反应，产物转化感受态大肠埃希菌DH5α，卡那霉素筛选阳性克隆，进行菌液PCR、提取质粒行PCR和双酶切鉴定后选取阳性克隆菌液送公司测序。提取测序正确的阳性菌株质粒转化感受态大肠埃希菌BL21(DE3)，并再次行PCR和质粒双酶切鉴定阳性菌株。同时取pET28a-EGFP重组质粒和pET28a空质粒转化感受态大肠埃希菌BL21(DE3)作为对照。

1.5 sTim-3-EGFP重组蛋白的诱导表达、鉴定及条件优化

1.5.1 诱导sTim-3-EGFP重组蛋白表达的IPTG浓度最佳化 荧光显微镜下观察单菌落培养菌液，选取荧光较强的一管进行后续IPTG诱导表达。根据预实验结果，我们先于37 ℃、225 r/min培养约2 h 45 min至A600 nm值达0.6左右吸取1 mL诱导前菌液，随后在0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、2.0、5.0 mmol/L等不同IPTG浓度下于25 ℃诱导表达6 h；每管吸取2.5 μL菌液于玻片上，在荧光显微镜下观察荧光强度；另每组各吸取1 mL菌液，离心弃去上清，加入160 μL PBS和40 μL 5×蛋白上样缓冲液，吹打混匀后沸水浴5 min，行SDS-PAGE电泳、考马斯亮蓝染色及Western blot检测。

1.5.2 sTim-3-EGFP重组蛋白的诱导时机最佳化 在25 ℃、0.1 mmol/L IPTG浓度下不同时机的诱导表达，分别取诱导前、A600 nm值分别为0.23、0.36、0.50、0.64、0.81、1.02、1.18时诱导表达6 h的菌液1 mL，离心弃去上清行SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色分析。

1.5.3 sTim-3-EGFP重组蛋白的诱导时间及温度最佳化 0.1 mmol/L IPTG浓度下不同时间和温度的诱导表达，在25℃的诱导前及诱导后1、2、3、4、5、6 h，31 ℃的诱导前、诱导后6 h，37 ℃的诱导前、诱导后6 h，各吸取1 mL菌液离心弃去上清，后进行SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色。同时取pET28a质粒及pET28a-EGFP重组质粒转化BL21(DE3)作为对照。

2 结果

2.1 Tim-3胞外段基因的RT-PCR结果

根据设计的引物扩增目的基因，Tim-3胞外段片段大小约620 bp，PCR产物经1.2%的琼脂糖凝胶电泳显示，在相对于DNA Marker 500 bp与750 bp之间有一特异性扩增条带，分子量大小与预期相符(图1)。

①：Tim-3胞外段基因RT-PCR扩增产物；②：250 bp DNA Ladder Marker图1 Tim3胞外段基因RT-PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果Fig.1 Agarose gel electrophoresis of RT-PCR products of the extracellular domain of Tim-3 gene

2.2 重组质粒pET28a-sTim-3-EGFP的鉴定

将扩增产物sTim-3经NcoⅠ和SacⅠ双酶切，并用DNA纯化试剂盒按厂家说明书纯化回收备用。双酶切纯化的sTim-3片段亚克隆于经过相同内切酶双酶切后的pET28a-EGFP载体上。连接产物转化感受态大肠埃希菌DH5α，后对单菌落培养菌液行sTim-3片段和EGFP片段的PCR鉴定(图2)，可见2、3号管菌液鉴定阳性；后对鉴定阳性的2号管菌液扩大培养提取质粒，对质粒进行sTim-3片段PCR鉴定及双酶切鉴定(图3)，结果与预期相符。将2号管菌液送上海生物工程技术公司测序，序列与GenBank中序列比对一致，无突变与移位。

M：DNA Marker；①～⑤：分别对应第1～5号管菌液的EGFP片段扩增产物；⑥～⑨：分别对应1～5号管菌液的sTim-3片段PCR扩增产物；其中第2、3号管菌液的sTim-3片段和EGFP片段扩增产物均有目的条带出现图2 重组质粒pET28a-sTim-3-EGFP的菌液PCR鉴定Fig.2 Identification of the recombinant plasmid pET28a-sTim-3-EGFP by bacteria liquid PCR

①：pET28a-EGFP质粒的SacⅠ和NcoⅠ双酶切产物；②：pET28a-EGFP质粒；③：新构建质粒的SacⅠ和NcoⅠ双酶切产物；④：提取的新构建质粒；⑤：新构建质粒的sTim-3片段图3 重组质粒pET28a-sTim-3-EGFP的PCR鉴定及双酶切鉴定Fig.3 Identification of recombinant plasmid pET28a-sTim-3-EGFP by double restriction enzyme digestion and PCR

2.3 重组质粒pET28a-sTim-3-EGFP在BL21(DE3)中的诱导表达、鉴定与条件优化

2.3.1 诱导sTim-3-EGFP重组蛋白表达的IPTG浓度最佳化 将鉴定阳性的重组质粒转化BL21(DE3)后，在不同IPTG浓度诱导下sTim-3-EGFP重组蛋白的诱导表达，荧光显微镜下观察可见在蓝色激发光下菌体发出较强的绿色荧光(图4)，SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色结果示重组蛋白大小与预期相符(sTim-3-EGFP融合蛋白大小理论值约为50.0 kD)；在一定范围内的IPTG浓度对蛋白表达量没有影响；同时取诱导前及诱导后菌液行Western blot检测进行验证，结果采用His标签单抗及EGFP单抗的验证均在目标位置出现单一条带(图5)。为了减少IPTG对细菌毒性作用，确定IPTG最佳浓度为0.1 mmol/L。

2.3.2 sTim-3-EGFP重组蛋白的诱导时机最佳化 为了找出IPTG诱导表达的最佳时机，我们在不同A600 nm值进行IPTG诱导表达sTim-3-EGFP。研究发现在A600 nm值为0.64和0.81时重组蛋白获得较高表达，随着A600 nm值增加，诱导培养6 h后的重组蛋白略有增加，但远不如菌体自身蛋白的增加明显(图6)。大约在2 h 45 min即A600 nm值在0.64与0.81之间时进行IPTG诱导为最佳。

2.3.3 sTim-3-EGFP重组蛋白的诱导时间及温度最佳化 经预实验，我们发现IPTG诱导6 h以上，蛋白表达无变化。为了找出IPTG诱导表达的最佳温度与诱导时间，我们分别进行不同时间及温度的诱导表达(图7)，可见25 ℃诱导5 h蛋白达到最大表达量，随时间增加表达量不再增加，不同温度诱导表达时表达量区别不大。为了减少sTim-3-EGFP重组蛋白的降解，确定IPTG诱导表达的最佳温度与诱导时间为25 ℃诱导5 h。

图4 荧光显微镜观察sTim-3-EGFP融合蛋白的表达(×400)Fig.4 Microscopic evaluation of sTim-3-EGFP fusion protein expression(×400)

A：SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色；①：蛋白Marker；②～⑨：pET28a-sTim-3-EGFP重组质粒组诱导前及0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、2.0、5.0 mmol/L的IPTG浓度下28 ℃诱导表达6 h；⑩：pET28a空质粒对照组。B：采用His标签单抗及EGFP单抗对重组蛋白进行的验证图5 不同IPTG浓度诱导下蛋白的表达及Western blot验证Fig.5 Expression of sTim-3-EGFP protein induced by different concentrations of IPTG and identification by Western blotting

①：蛋白Marker；②：pET28a-sTim-3-EGFP重组质粒组诱导前(A600 nm值为0.64)；③～⑨：A600 nm值分别为0.23、0.36、0.50、0.64、0.81、1.02、1.18时25 ℃进行诱导表达6 h；⑩：pET28a空质粒对照组图6 SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色检测不同时机诱导的重组蛋白表达Fig.6 Determination of expression of sTim-3-EGFP fusion protein with respect to different A600 nmvalues by SDS-PAGE electrophoresis and coomassie brilliant blue staining

①：蛋白Marker；②：pET28a-sTim-3-EGFP重组质粒组诱导前；③～⑧：25℃诱导后1、2、3、4、5、6 h；⑨：31℃诱导后6 h；⑩：37℃诱导后6 h图7 SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色检测不同诱导时间和温度下的诱导表达Fig.7 Determination of expression of sTim-3-EGFP fusion protein with respect to different induction time and temperature by SDS-PAGE electrophoresis and coomassie brilliant blue staining

3 讨论

Tim-3是在多种免疫细胞上表达的一种跨膜蛋白，在机体的固有免疫和特异性免疫应答方面都起着重要的调节作用。由于Tim-3在多种类型疾病的免疫调节中具有重要作用，尤其是在肿瘤免疫治疗领域作为治疗靶点的潜在意义巨大，因此Tim-3的研究成为近几年的研究热点。作为一种负性免疫调节分子，Tim-3与配体Gal-9的结合产生的信号可以阻止Th1细胞的激活而负向调节细胞免疫功能，阻断或增加这一结合有望改变与Th1/Th2比例失衡相关疾病的发展方向。Tim-3与Ceacam-1的相互作用被证明可以导致T细胞对各类疾病产生免疫耐受[10]，这在自身免疫性疾病中具有积极的作用，而在癌症的发展过程中却存在消极影响。而Tim-3与这些配体结合发生作用的具体下游信号传导通路尚需深入研究。

作为与PD-1、CTLA-4相似的分子，Tim-3已成为免疫治疗与药物研发领域热门的靶点分子。在肿瘤免疫治疗领域，以PD-1/PD-L1为靶点的单抗已经应用于临床，对黑色素瘤及非小细胞肺癌等实体瘤显示出良好的疗效，但仍有很多患者对于这一治疗无响应。而实验研究中发现，抗Tim-3单抗和抗PD-1药物联合使用比单独使用抗Tim-3或抗PD-1可以起到更好的抗肿瘤效果。其他的研究也显示抗Tim-3与抗CTLA-4的组合使用可以提高抗肿瘤免疫反应，促进肿瘤消退[11-12]；其中的一项研究还发现抗Tim-3治疗与立体定向放射外科(stereotactic radiosurgery，SRS)联合应用或抗Tim-3与抗PD-1的联合应用相比单独的抗Tim-3治疗能够改善患胶质瘤小鼠的存活，而3种治疗方法的结合可以达到100%的总生存率[12]。另外，最近的研究显示Tim-3阻断和丝裂原活化的细胞外信号调节激酶(mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase，MEK)抑制剂的联合应用能够增强对黑色素瘤的疗效[13]。这些研究提示针对Tim-3与其他免疫检查点进行肿瘤治疗可能具有重要作用，并有巨大的应用潜力。

目前已知序列基因组中膜蛋白占所有开放阅读框中的20%～25%，在疾病中起重要作用[14]。而且，所有药物靶标约有70%是膜蛋白[15]。然而，由于其本身含量低，膜蛋白常常很难分离足够量的天然蛋白质。Tim-3作为一种膜蛋白，在真核细胞中的表达量很低，使其功能研究受到了很大的限制。Tim-3可溶性形式(sTim-3)的发现，也尚有待更深入的研究。本实验中，我们采用pET28a作为表达载体对sTim-3进行高效表达，同时引入EGFP标签以监测可溶性蛋白的表达，以获得高丰度且具有较多可溶性的sTim-3-EGFP重组蛋白。因为保留了C端的His标签，可以很方便地采用Ni-NTA(或Ni-IDA)亲和层析介质进行蛋白纯化和后续功能研究。考虑到外源基因的异源表达受多种因素的影响，我们对IPTG浓度、诱导时机、诱导时间和诱导温度进行了探索，发现IPTG浓度和诱导温度对重组蛋白的表达量影响不大，诱导时机和诱导时间可能是影响重组蛋白在大肠埃希菌中表达的最重要因素。但过高浓度的IPTG对细菌有潜在的毒性，后续的实验我们采用了较低浓度的IPTG进行诱导。温度虽然对蛋白的最大表达量影响不大，但温度高时大肠埃希菌表达的异源蛋白容易被降解，同时较高温度下重组蛋白的高速表达不利于蛋白的正确折叠，易产生不具有生物活性的不可溶性形式(包涵体表达)，而包涵体纯化后的复性较为复杂且不能确保复性成功，故我们建议尽可能采用低温诱导。诱导时机的探索中，我们发现在A600 nm值约为0.6～0.8时重组蛋白可获得较高表达，随着A600 nm值继续增加，诱导培养6 h后重组蛋白的增加远不如因A600 nm值增加导致的菌体自身蛋白的增加明显，不利于后续的蛋白纯化，建议培养至此范围时进行诱导。综上，sTim-3-EGFP重组蛋白最佳诱导条件为：A600 nm值约为0.6～0.8时，用0.1 mmol/L IPTG在25 ℃诱导约5 h。

总之，我们成功构建pET28a-sTim-3-EGFP表达载体，在C末端引入EGFP标签以监测sTim-3的可溶性表达，EGFP下游的His6标签便于Ni-NTA纯化。并且对sTim-3-EGFP原核表达的最佳条件进行摸索，为sTim-3-EGFP纯化和功能研究及临床应用奠定了坚实基础。

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(2017-03-08 收稿)

Construction and Optimized Expression of Recombinant Human sTim-3-EGFP Fusion Protein

Bai Shaoyun1，Qing Jilin2，Liu Zhen1etal

1DepartmentofNeurosurgery，theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity，Nanning530021，China2DepartmentofGynecology，ThePeople’sHospitalofGuangxiZhuangAutonomousRegion，Nanning530021，China

Objective To construct and optimize the condition for inducing expression of recombinant human sTim-3-EGFP inE.coli.Methods Total RNA was extracted from peripheral blood of healthy people.The extracellular fragment of human Tim-3 gene was amplified by RT-PCR and cloned into the constructed prokaryotic expression vector pET28a-EGFP，and identified by PCR，double digestion and sequencing.The recombinant plasmid was transformed into BL21(DE3)to optimize protein expression by adjusting IPTG concentration，induction starting time，induction temperature and induction expression time.Results The prokaryotic expression vector pET28a-sTim-3-EGFP was successfully constructed and transformed into BL21(DE3)for expression.The temperature and IPTG concentration had little effect on the protein expression.When theA600 nmvalue was about 0.6-0.8，temperature 25°C and induction time 5 h，higher protein expression could be obtained.Conclusion The human sTim-3-EGFP is successfully constructed and expressedinvitro.This study provides a good experimental basis for further purification，production and application of Tim-3.

T-cell immunoglobulin and mucin-domain containing-3； prokaryotic expression； enhanced green fluorescent protein； fusion protein

*国家自然科学基金资助项目(No.81260007)；广西卫生厅课题资助项目(No.Z2012316)

R

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.03.007

白少云，男，1988年生，硕士研究生，E-mail：baishaoyun1988@126.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：neurosurgui@vip.163.com(谭源福)；E-mail：tjchenzz@126.com(陈治中)