母代营养过剩对雄性子代能量代谢的影响*

周 群， 李 炯， 张 燚， 关蕴良， 王 萍， 张 果

华中科技大学同济医学院公共卫生学院毒理学系，武汉 430030

母代营养过剩对雄性子代能量代谢的影响*

周 群， 李 炯， 张 燚， 关蕴良， 王 萍， 张 果△

华中科技大学同济医学院公共卫生学院毒理学系，武汉 430030

目的 探究母代营养过剩对雄性子代能量代谢的影响。方法 C57BL/6J雌鼠随机分为高脂饮食组和正常饮食组，分别饲喂高脂或正常饲料2个月，然后与正常饮食C57BL/6J雄鼠交配，孕鼠在孕期和哺乳期继续摄取高脂或正常饲料。子一代雄鼠性成熟后与正常饮食C57BL/6J雌鼠交配得到子二代，子二代雄鼠性成熟后再与正常饮食C57BL/6J雌鼠交配得到子三代。测定子一代、子二代、子三代雄性小鼠体重、摄食量及随机血糖值。对子一代和子二代成年雄性小鼠进行腹腔糖耐量实验并记录肝脏、附睾周脂肪、皮下脂肪湿重值。检测子二代成年雄性小鼠血清胰岛素及下丘脑能量代谢相关基因表达情况。结果 营养过剩母鼠子一代和子二代雄性小鼠的体重、摄食量、能量摄入量及随机血糖值均高于对照组(均P<0.05)，子三代之间的差异则无统计学意义(P>0.05)。营养过剩母鼠子一代和子二代的成年雄性小鼠的附睾周脂肪脂体比、皮下脂肪脂体比、肝体比及糖耐量曲线下面积均高于对照组(均P<0.05)。营养过剩母鼠子二代成年雄性小鼠的血清胰岛素浓度及下丘脑神经肽Y(NPY)、刺鼠相关蛋白(AGRP)、甘丙肽(GAL)、可卡因-安他非明转录调节肽(CART)、SIM1基因的表达量均高于对照组(均P<0.05)。结论 高脂饮食诱导的营养过剩母代对雄性子代能量代谢的影响可持续至子二代，引起子二代下丘脑能量代谢相关基因表达异常。

营养过剩； 能量代谢； 子代； 能量代谢相关基因

20世纪90年代，英国Barker教授首次提出了成人疾病的胚胎起源假说，该假说认为胎儿宫内营养不良可导致一系列成人能量代谢障碍性疾病的发生[1]。随着大量有关母亲营养状态与后代疾病之间相关性的研究得以开展，该学说逐渐发展成为“健康与疾病的发育起源(developmental origins of health and disease，DOHaD)”学说。近年来全球肥胖人口不断增加[2]，育龄肥胖妇女比例也不断升高[3]，DOHaD逐渐成为研究的热点。由于中国人倾向于在生产前后和哺乳期间给孕产妇提供过量营养，因此孕产妇营养过剩的情况更为普遍[4-5]。

除了饮食和生活方式，母亲的营养状态直接决定着胚胎发育所处的宫内环境，这会对后代生长发育产生重要影响[6-7]。母亲在孕期过量摄取高热量食物会引起胎儿大脑中枢神经系统发育异常，改变后代大脑神经环路，使得后代更倾向于摄入高热量食物，引发能量代谢障碍性疾病[8]。

当能量摄入超过能量支出时，能量会以脂肪的形式在体内储存起来，脂肪储存过量便引起肥胖。下丘脑是机体调节能量平衡的高级神经中枢[9]，它可以对机体能量状态作出应答，通过多种神经肽共同调节食物摄取和能量消耗[10]。

母代营养过剩会导致子代出现能量代谢紊乱，但是这种不良影响可持续多久仍不清楚。此外，母代营养过剩对子二代下丘脑能量代谢相关基因的影响及潜在机制仍有待研究。本研究通过孕前、孕中和哺乳期给予母鼠高脂饮食构建母代营养过剩模型，探讨母亲营养过剩对后代雄鼠肥胖发生的影响，并重点考察子二代下丘脑能量代谢相关基因的表达变化，为防治肥胖等代谢综合征提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物及饲料

5～6周龄C57BL/6J雌性小鼠50只，体重13～15 g，5～6周龄C57BL/6J雄性小鼠20只，体重18～20 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，饲养于SPF级动物房。正常饲料(Chow)购自北京华阜康生物科技股份有限公司，所含热量为18.87 kJ/g，热量百分比为：蛋白质20%，脂肪10%，碳水化合物70%。高脂饲料(high fat diet，HFD)购自江苏美迪森生物医药有限公司，所含热量为29.25 kJ/g，热量百分比为：蛋白质20%，脂肪60%，碳水化合物20%。

1.2 实验动物模型建立

动物模型建立流程如图1。将6周龄的C57BL/6J雌鼠(F0代)分别用高脂饲料(HFD)和正常饲料饲养(Chow)2个月后，将其与相同年龄的正常饲料饲养的C57BL/6J雄鼠进行交配。F0代雌鼠在孕期和哺乳期继续原有饮食模式，但子一代(F1)在离乳后均给予正常饲料喂养，分别为F1(H-C)组和F1(C-C)组。然后将成年F1代雄鼠继续与同龄的正常食物喂养的C57BL/6J雌鼠进行交配，由此得到的子二代(F2)仍然给予正常饲料喂养，即F2(H-C-C)组和F2(C-C-C)组。同样方法得到F3(H-C-C-C)组和F3(C-C-C-C)组。

图1 动物模型建立流程Fig.1 Establishment process of animal model

1.3 实验方法

1.3.1 动物体重及组织重量测定 每隔2 d测1次体重及摄食量。待动物成年后，每组处死6～8只，测定肝脏、附睾周脂肪及皮下脂肪的湿重。根据如下公式计算肝体比和脂体比：肝体比(%)=肝脏重量(g)/体重(g)×100%，脂体比(%)=脂肪重量(g)/体重(g)×100%。所有操作均通过作者所在单位实验动物伦理委员会的审核批准。

1.3.2 随机血糖值及血清胰岛素浓度的测量 待动物成年后，每组取6～8只使用欧姆龙血糖仪测小鼠血糖值，此即随机血糖值。然后尾部取血，离心取血清，使用日本Shibayagi公司的胰岛素ELISA试剂盒严格按照说明书测量血清胰岛素浓度。

1.3.3 腹腔糖耐量实验 待动物成年后，每组取6～8只禁食16 h，然后使用欧姆龙血糖仪测小鼠血糖值，此时测得的血糖为小鼠空腹时的血糖(0 min)。接着给小鼠腹腔注射2 g/kg体重的葡萄糖，注射完时的时间定为0 min并开始正计时。在注射完葡萄糖后的15、30、60和120 min分别测血糖值并记录。采用梯形累加法[11]计算糖耐量曲线下面积(Area under the curve，AUC)：AUC=(T0+T15)×15/2+(T15+T30)×15/2+(T30+T60)×30/2+(T60+T120)× 60/2(其中T0、T15、T30、T60、T120分别指第0、15、30、60、120 min的血糖值)。

1.3.4 实时荧光定量PCR检测下丘脑能量代谢相关基因的表达 每组取6～8只成年雄性小鼠，严格按照Trizol说明书提取小鼠下丘脑总RNA。测定RNA浓度及纯度后，取1 μg RNA进行琼脂糖凝胶电泳检验RNA质量。取1 μg总RNA，利用东洋纺(上海)生物科技公司的逆转录试剂盒得到cDNA。以cDNA作为模板，引物序列见表1，根据大连宝生物工程有限公司的荧光定量PCR试剂盒，在荧光定量PCR仪(7900 HT)中进行反应，最终测得基因的相对表达量。

表1 下丘脑能量代谢相关基因及β-actin引物序列

1.4 统计学分析

采用SPSS 12.0统计软件进行分析，实验数据以均数±标准差的形式表示，采用独立样本t检验进行分析。以P<0.05为差异有统计学意义，0.05

2 结果

2.1 高脂喂养诱导母代营养过剩模型

母代小鼠在饲喂高脂饲料后，到第2周小鼠体重即开始超过对照组(P=0.021)，之后高脂组母代小鼠体重始终高于对照组小鼠(图2A)。如图2B和图2C所示，配种前高脂喂养母代小鼠的体重已明显高于对照组(P=0.001)，其随机血糖浓度也明显增高(P=0.000)。此外，对即将配种母代小鼠进行腹腔糖耐量实验后发现高脂组各时点的血糖值也显著高于对照组，其糖耐量曲线下面积相对于正常饮食小鼠也显著增高(图2D)。

2.2 子代体重、摄食量及能量摄入量变化

子一代小鼠H-C组体重离乳前即开始大于C-C组，子二代小鼠H-C-C组在9周龄时体重开始大于C-C-C组，子三代小鼠H-C-C-C组体重与C-C-C-C组相比差异无统计学意义(图3A及图3B)。子一代H-C组和子二代小鼠H-C-C组小鼠从2月龄开始其摄食量和能量摄入量即开始超过对照组，然而子三代H-C-C-C组小鼠摄食量和能量摄入量与对照组的差异无统计学意义(图3C及图3D)。

2.3 子代肝体比和脂体比

每组随机挑选6～8只成年雄性小鼠进行解剖，称取组织湿重，计算肝体比和脂体比，结果如图4所示，子一代H-C组和子二代H-C-C组小鼠的肝体比、附睾周脂肪脂体比、皮下脂肪脂体比均高于对照组小鼠(均P<0.05)。

2.4 子代随机血糖、糖耐量及血清胰岛素水平

检测子一代、子二代、子三代成年雄性小鼠的随机血糖值发现，子一代H-C组和子二代H-C-C组小鼠的随机血糖值均高于对照组，子三代H-C-C-C组小鼠的随机血糖值与对照组相比差异无统计学意义(图5A)。挑选8～10只成年雄性小鼠进行腹腔糖耐量实验，由图5B及图5C可知，子一代H-C组和子二代H-C-C组小鼠的糖耐量曲线下面积均比对照组小鼠高。此外，随机挑选6～8只子二代成年雄性小鼠检测其血清胰岛素浓度后发现，C-C-C组的胰岛素浓度为(0.195±0.006)ng/mL，H-C-C组的胰岛素浓度为(0.278±0.027)ng/mL，H-C-C组的血清胰岛素浓度显著高于对照组小鼠(P=0.007)。

A：母代小鼠体重变化；B：母代小鼠配种前体重；C：母代小鼠配种前随机血糖值；D：母代小鼠配种前糖耐量情况；与对照组比较，*P<0.05图2 母代小鼠体重、随机血糖及糖耐量情况Fig.2 Weight，random blood glucose and glucose tolerance of maternal mice

A：子代小鼠离乳前体重变化；B：子代小鼠离乳后体重变化；C：子代小鼠摄食量变化；D：子代小鼠能量摄入量变化；与对照组比较，*P<0.05 0.05<#P<0.1图3 子代小鼠离乳前体重变化和离乳后体重、摄食量及能量摄入量变化Fig.3 Changes in body weight before weaning and body weight，food intake and energy intake after weaning

A：子一代小鼠肝体比、附睾周脂肪脂体比、皮下脂肪脂体比；B：子二代小鼠肝体比、附睾周脂肪脂体比、皮下脂肪脂体比；与对照组比较，*P<0.05 图4 子代小鼠的肝体比和脂体比Fig.4 Hepatosomatic index and body-fat ratio of offspring

A：子代小鼠的随机血糖水平；B：子一代小鼠糖耐量情况；C：子二代小鼠糖耐量情况；与对照组比较，*P<0.05 图5 子代小鼠的随机血糖和糖耐量情况Fig.5 Random blood glucose and glucose tolerance of offspring

2.5 子代下丘脑能量代谢相关基因表达水平

对子二代小鼠下丘脑7种能量代谢相关基因进行荧光定量PCR分析，由图6可知，H-C-C组小鼠下丘脑神经肽Y(neuropeptide Y，NPY)、刺鼠相关蛋白(agouti-related peptide，AGRP)、甘丙肽(galanin，GAL)、可卡因-安他非明转录调节肽(cocaine-and amphetamine-regulated transcript，CART)、SIM1(single-minded 1)的表达量相对于对照组上调明显(均P<0.05)，促甲状腺激素释放激素(thyrotropin-releasing hormone，TRH)表达量相对于对照组有降低趋势(P=0.068)，阿片-促黑素细胞皮质素原(proopiomelanocortin，POMC)表达量在H-C-C组和C-C-C组间没有明显差异(P=0.190)。

与对照组比较，*P<0.05，0.05<#P<0.1 图6 子二代小鼠的下丘脑能量代谢相关基因表达水平Fig.6 Hypothalamic energy metabolism-related gene expression levels of second generation mice

3 讨论

近年来，肥胖不仅在中国，而且在世界范围内的发病率不断攀升。除了不良饮食习惯和生活方式外，胚胎发育所处的宫内环境对成年期能量代谢的影响也不容忽视。大量研究表明，孕产妇营养过剩对后代会产生多种不良影响，包括肥胖、糖尿病、非酒精性脂肪肝等多种代谢障碍性疾病[12-14]。

本研究首先通过在孕前期、孕期和哺乳期对母代小鼠持续高脂喂养构建母代营养过剩模型。母代小鼠在配种前其体重就已经超过对照组小鼠，表明母代小鼠此时已经出现脂代谢紊乱。此外，高脂喂养的母代小鼠的随机血糖值及腹腔糖耐量曲线下面积均大于正常饮食组，这说明小鼠已经对葡萄糖不耐受，出现糖代谢紊乱。由上述事实可知，母代小鼠在高脂食物喂养后，其摄入的营养远远超过了身体的需求量，导致母代小鼠出现糖脂代谢紊乱，故而母代营养过剩模型构建成功。

本研究发现母代营养过剩的子一代雄鼠从离乳前体重就开始超过对照组小鼠，而母代营养过剩的子二代雄鼠在9周龄时体重才开始超过对照组小鼠，然而母代营养过剩的子三代雄鼠的体重与对照组相比差异始终无统计学意义。此外，母代营养过剩的子一代和子二代雄鼠从2月龄开始进食量及能量摄入量均超过对照组，而子三代雄鼠之间差异始终无统计学意义。进一步对子代成年雄鼠的随机血糖值检测后发现，母代营养过剩的子一代和子二代雄鼠的随机血糖值均大于对照组，而子三代之间差异仍无统计学意义。这些事实证明，母代营养过剩对子代雄鼠的影响可一直持续至子二代。

有研究表明，母鼠高脂饮食可导致子一代成年期出现肥胖、糖脂代谢紊乱和非酒精性脂肪肝等能量代谢障碍性疾病[15-17]。本研究进一步发现，相对于对照组小鼠，母代营养过剩的子一代和子二代成年雄性小鼠的肝体比、附睾周脂肪脂体比、皮下脂肪脂体比更高，且糖耐量曲线下面积更大。这进一步证实母代营养过剩不仅导致子一代，而且可导致子二代出现能量代谢障碍。

由于目前有关母代营养过剩对子二代影响的研究相对较少，本研究对子二代进行了更加深入的研究。胰岛素是体内唯一能够降低血糖的激素，它在能量调控中起着十分重要的作用。对子二代血清胰岛素浓度检测后发现，母代营养过剩的子二代表现为高胰岛素血症。其结果与预期相符，因为肥胖人群会出现胰岛素抵抗现象，此时机体会代偿性地分泌过量胰岛素到血液中[18]。下丘脑作为机体调控能量平衡的高级中枢，表达多种能量代谢相关基因。NPY、AGRP、GAL是下丘脑主要的增强食欲的神经肽，POMC、CART是下丘脑主要的抑制食欲的神经肽[19]。SIM1基因能够调控下丘脑视上核和室旁核的发育，影响机体摄食量[20]。TRH是下丘脑分泌的一种激素，可以通过垂体甲状腺轴调控甲状腺激素的释放，进而调控能量代谢[21]。定量PCR结果表明，母代营养过剩的子二代表达较高水平的NPY、AGRP、GAL、CART、SIM1基因，其TRH表达量相对于对照组有增高趋势。可以推测，母代营养过剩影响了子二代下丘脑能量代谢相关基因表达量，这可能是其引起后代出现能量代谢障碍性疾病的潜在机制。

综上所述，高脂饮食所致母代营养过剩可改变子一代雄鼠胚胎发育期的宫内环境，引起子一代雄鼠出现糖脂代谢异常。然后，子一代雄鼠可以将这种不良影响传递给子二代雄鼠，使子二代雄鼠下丘脑能量代谢相关基因表达异常，也出现糖脂代谢紊乱。但是这种来自母代的不良影响不会传递到子三代。这个过程中所涉及的具体机制仍然有待进一步研究。

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(2017-03-01 收稿)

Effect of Maternal Nutrient Excess on Energy Metabolism of Male Offspring

Zhou Qun，Li Jiong，Zhang Yietal

DepartmentofToxicology，SchoolofPublicHealth，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China

Objective To explore the effect of maternal nutrient excess on the energy metabolism of male offspring.Methods C57BL/6J female mice were randomly divided into high fat diet group and normal diet group.They were fed with high fat or normal diet for 2 months and then mated with C57BL/6J male mice fed on normal diet.Pregnant mice continued to ingest high fat or normal diet during pregnancy and lactation.After sexual maturation，the male mice of first generation were mated with C57BL/6J female mice fed on normal diet.The mature male mice of the second generation were then mated with C57BL/6J female mice fed on normal diet to obtain the third generation.The body weight，food intake and random blood glucose level were measured in the male mice of the first，second and third generation.Abdominal glucose tolerance test was performed on the adult male mice of the first and second generation.The wet weight of liver，epididymal fat and subcutaneous fat was also recorded.The levels of serum insulin and expression of hypothalamic energy metabolism related genes were detected in the adult male mice of the second generation.Results The body weight，food intake，energy intake and randomblood glucose levels of the mice of the first and second generation with nutritional excess mothers were significantly higher than those of the control group (allP<0.05)，and the differences between the third generation mice and the control group were not statistically significant(P>0.05).Compared with the control group，the body-fat ratio of epididymal fat and subcutaneous fat，hepatosomatic index and area under the curve of glucose tolerance were higher in the first and second generation mice with nutritional excess mothers(allP<0.05).The serum insulin level and expression of Neuropeptide Y(NPY)，Agouti-Related Peptide(AGRP)，Galanin(GAL)，Cocaine-and Amphetamine-Regulated Transcript(CART)and Single-minded 1(SIM1)in the second generation male mice with nutritional excess mothers were significantly higher than those in the control group(allP<0.05).Conclusion The influence of high fat diet induced nutritional excess mothers on the energy metabolism of male offspring may continue to the second generation，which may cause the abnormal expression of energy metabolism related genes in hypothalamus.

nutrient excess； energy metabolism； offspring； energy metabolism related genes

*华中科技大学青年教师基金资助项目(No.2015QN110)

R151.41

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.03.004

周 群，男，1989年生，硕士研究生，E-mail：aotuxiumu@163.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：gzhang@hust.edu.cn