基于基因数据库分析CD44在胶质瘤中的表达及意义*

郭秋云， 胡广原， 韩 娜， 石 磊， 于 洋， 陈承奇， 张孟贤

华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤中心，武汉 430030

论 著

基于基因数据库分析CD44在胶质瘤中的表达及意义*

郭秋云， 胡广原， 韩 娜， 石 磊， 于 洋， 陈承奇， 张孟贤△

华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤中心，武汉 430030

目的 研究CD44在胶质瘤中的表达和临床意义，以及CD44下调对胶质瘤细胞增殖、侵袭和凋亡的影响。方法 检索Oncomine数据库中关于CD44的信息，对其在各类型肿瘤及胶质瘤中的表达情况进行检索。利用R2基因分析可视化平台及TCGA数据库中下载的胶质瘤基因芯片数据集，分析CD44的表达水平与胶质瘤患者预后的关系。通过siRNA抑制CD44的表达，通过CCK-8试验、Transwell小室、流式细胞术检测CD44下调对胶质瘤U251细胞增殖、侵袭和凋亡的影响。结果 Oncomine数据库中共收集了467项不同肿瘤类型的关于CD44的研究结果，对比正常组织，有统计学差异的结果有68项，其中CD44表达增高的有51项，表达降低的有17项。胶质瘤中高表达的有10项，未搜索到低表达的项目，10项研究共包括955例样本。分析R2基因分析可视化平台(包含504例胶质母细胞瘤)及TCGA数据库(包含529例低级别胶质瘤)的基因芯片数据发现，CD44高表达患者预后更差。在胶质母细胞瘤中CD44高、低表达组患者2年生存率分别为13%和25%(P=0.000 1)，在低级别胶质瘤中CD44高、低表达组患者5年生存率分别为47%和61%(P=0.001 0)。采用特异性针对CD44基因的siRNA转染U251胶质瘤细胞可显著抑制CD44的表达，与阴性对照组和空白对照组相比，转染组的细胞增殖和侵袭明显受到抑制，且流式细胞学显示转染组对比阴性对照组细胞凋亡率增加，分别为7.10%和4.11%(P<0.05)。结论 CD44在胶质瘤中高表达，可作为胶质瘤预后判断指标及潜在的治疗靶点。

胶质瘤； CD44； Oncomine数据库； siRNA

胶质瘤是由神经外胚层分化而来的胶质细胞发生的肿瘤，是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤，占脑原发肿瘤的70%左右，WHO将胶质瘤的恶性程度分为4级，其中Ⅰ级和Ⅱ级也称为低级别胶质瘤(brain lower-grade glioma)，Ⅲ级为间变型星型细胞瘤，Ⅳ级为多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme)。级别越高，恶性程度越高，预后越差。目前该病的治疗手段主要为手术治疗及术后的选择性放化疗，对于低级别胶质瘤仍有相当一部分患者会出现术后复发，而胶质母细胞瘤占所有胶质瘤的50%，其中位生存期仅有12～15个月[1]。当务之急是如何寻找可靠的治疗靶点及预后判断指标。

近年来各种高通量技术产生了大量的细胞系和组织生物学表达谱数据及高通量测序数据，存储在各大数据库中。Oncomine数据库是目前世界上最大的肿瘤基因芯片数据库及整合数据提取平台，目前包括近100种肿瘤类型，715个数据集和86 733个组织芯片结果。利用数据挖掘可分析靶基因在肿瘤组织及其相应正常组织中的表达差异，同时也可获得靶基因表达与患者的总生存时间等临床资料的关系。另外一些可视化的基因数据分析平台例如R2平台也为我们提供了强大的基因及临床数据分析功能。一些大的数据库(例如TCGA数据库)还提供基因及临床数据下载功能，我们可以利用下载的基因表达数据及临床数据进一步分析。

肿瘤干细胞学说的提出及胶质瘤干细胞的分离与鉴定成功，为胶质瘤的研究提供了新的切入点[2]。CD44是肿瘤干细胞的标记物，与肿瘤的发生、发展密切相关[3]。本研究试图通过Oncomine数据库中CD44的相关研究检索分析，探讨CD44在胶质瘤中的表达水平，分析其表达水平与患者预后的关系，并进一步通过实验验证CD44对胶质母细胞瘤细胞的增殖、侵袭、凋亡的作用。

1 材料与方法

1.1 利用Oncomine数据库分析胶质瘤中CD44的表达

在Oncomine数据库中设定筛选条件，①Cancer Type：glioma；②Gene：CD44；③Data Type：mRNA；④Sample Type：Clinical Specimen；⑤Analysis Type：Cancervs.Normal Analysis；⑥临界值设定条件Pvalue<1×10-4，fold change>2，gene rank=top 10%。

1.2 生存分析

利用R2基因分析可视化平台的Kaplan-meier功能分析胶质母细胞瘤中CD44表达高低与预后的关系；从公共基因芯片数据库TCGA中寻找并下载低级别胶质瘤基因芯片数据，应用R语言软件进行Kaplan-meier分析，绘制生存函数曲线，用Log-rank test法进行差异显著性检验。

1.3 实验材料

U251胶质瘤细胞购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，由本实验室冻存；抗CD44单克隆抗体购自美国Cell Signal Technology公司；AnnexinⅤ-APC细胞凋亡检测试剂盒购自eBioscience公司；Transwell小室购自美国BD公司；CCK-8细胞计数试剂盒购自Sigma公司。

1.4 CD44 siRNA的设计与合成

根据siRNA的设计原则设计3对不同的针对CD44 cDNA(GenBank：NM _000610.3)符合特征的靶序列，同时设计无关对照序列。应用脂质体LipofectamineTM2000转染试剂将3对siRNA转染U251胶质瘤细胞，Western blot法检测CD44蛋白表达以确定干扰效果。从中选取干扰效果最明显的靶序列：5′-UGCCUUUGAUGGACCAAUU-3′，无关对照序列：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′，进行下一步实验。siRNA由上海吉凯基因公司合成。

1.5 细胞培养和siRNA转染

采用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液，在37℃、体积分数为5% CO2培养箱中培养U251细胞。调整细胞密度，接种无菌6孔板，每孔约1×106个细胞。待其生长至80%融合时，按照lipofectamine 2000脂质体转染试剂盒说明书进行操作，将靶序列和无关序列转染到U251细胞系中，分别作为转染组(KD)和阴性对照组(NC)，未转染的U251细胞作为空白对照组(CON)。

1.6 CD44蛋白表达检测

采用Western blot法检测CD44蛋白的表达。siRNA转染72 h后收集细胞，加入细胞裂解液，提取细胞总蛋白，用BCA试剂盒检测蛋白质浓度，制备10% SDS-PAGE凝胶，每孔上样50 μg，经电泳、转膜、封闭后，依次与CD44抗体(1∶200)及辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶500)反应1 h，化学发光法(ECL)曝光显影，冲洗胶片，用紫外分光光度计扫描条带灰度值，以GAPDH为内参照，计算蛋白质表达水平。实验重复3次，取平均值作图。

1.7 细胞增殖分析

采用CCK-8试剂盒检测细胞的增殖能力。细胞转染培养72 h后，胰酶消化，完全培养液重悬成细胞悬液并计数。96孔板每孔铺3 000个细胞，每组设3个复孔。分别于铺板后的24、48、72、96、100 h每孔加入10 μL CCK-8试剂，培养箱中孵育4 h后，96孔板置于振荡器上振荡2 min，用酶标仪检测450 nm波长的吸光度(A)值。实验重复3次，取平均值作图。

1.8 细胞凋亡分析

采用Annexin Ⅴ-APC单染法检测细胞凋亡。细胞转染培养72 h后，胰酶消化，完全培养液重悬成细胞悬液，1 300 r/min离心5 min，弃上清，4℃预冷的D-Hanks液洗涤细胞沉淀。1×binding buffer洗涤细胞沉淀1次，1 300 r/min离心3 min，收集细胞。200 μL 1×binding buffer重悬细胞沉淀。加入10 μL Annexin Ⅴ-APC染色，室温避光10 min，上机检测。

1.9 细胞侵袭能力检测

采用Transwell小室检测细胞侵袭能力。转染培养72 h后，将无FBS的DMEM高糖培养液500 μL加入上室，水化2 h。弃上室培养液，下室中加入750 μL含10%FBS的DMEM高糖培养液，胰酶消化，用含0.1%BSA的无血清DMEM高糖培养液重悬细胞，吸取含有1×105个细胞的悬液加入上室，补充上室溶液至500 μL。孵育24 h后吸弃上室溶液，用棉签擦去小室内侧壁未穿膜细胞，0.1%结晶紫染色，晾干，显微镜下观察计数穿膜细胞。

1.10 统计学分析

应用统计学软件SPSS 16.0进行统计学处理。生存分析采用Kaplan-Meier方法，组间差异采用Log-rank检验进行分析。细胞学实验采用单因素方差分析，实验均独立重复3次，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 CD44在所有肿瘤类型中的表达

Oncomine数据库中共收集了467项不同类型的研究结果。在设定的搜索条件下关于CD44表达有统计学差异的结果有68项研究，其中CD44表达增高的有51项，表达降低的有17项。在中枢神经系统肿瘤中高表达的研究有11项，其中10项为胶质瘤的研究，未搜索到低表达的研究。见表1。

表1 CD44在Oncomine数据库中所有肿瘤相关研究中的表达

注：1项研究中可能包含不止1种肿瘤类型。

2.2 CD44在胶质瘤中的表达

在Oncomine数据库中我们发现，从2003年起共有10项研究涉及CD44在胶质瘤组织和正常组织中的表达，共包括955例标本。荟萃分析显示与对照组相比，CD44在胶质瘤中高表达(P=1.73×10-8)。见图1。

2.3 CD44在不同研究芯片中癌组织和正常组织之间的表达差异

我们在上述研究中选择了样本量较大的4项研究分析CD44在不同胶质瘤研究芯片中的表达结果。在这4项研究中，CD44在胶质母细胞瘤、间变型星形细胞瘤、少突胶质瘤中的表达量均显著高于正常组织(均P<0.05)。见图2。

1～10分别表示10项研究结果，红色越深表示CD44基因在该芯片中表达越高图1 Oncomine数据库中胶质瘤CD44的表达情况Fig.1 Expression of CD44 in glioma in the studies of Oncomine database

图2 Oncomine数据库中CD44在不同胶质瘤芯片中的表达Fig.2 Expression of CD44 in glioma in different studies of Oncomine database

2.4 CD44表达与胶质瘤预后的关系

CD44在胶质瘤中表达增高，为了进一步明确CD44表达与胶质瘤预后之间的关系，我们利用R2基因分析可视化平台将504例胶质母细胞瘤病例分为CD44高表达组及低表达组，通过分析发现，高表达组患者2年生存率为13%，低表达组2年生存率为25%，高表达组预后明显差于低表达组(P=0.000 1)。为进一步研究CD44在低级别胶质瘤中的表达情况，我们通过TCGA数据库下载了529例低级别胶质瘤的基因芯片数据，根据CD44基因表达中位水平分为高表达组和低表达组，通过Kaplan-meier分析发现，CD44高表达组患者5年生存率为47%，低表达组5年生存率为61%，高表达组预后明显差于低表达组(P=0.001 0)。见图3。

图3 CD44表达与多形性胶质母细胞瘤(A)及低级别胶质瘤(B)预后的关系Fig.3 Relationship between expression of CD44 and overall survival time (OS) of patients with glioblastoma (A) or low grade glioma (B)

2.5 siRNA对CD44蛋白表达的影响

Western blot结果显示，以GAPDH作为内参，转染组U251细胞内CD44的表达量显著下降，而阴性对照组和空白对照组CD44表达量几乎没有发生变化(图4)。提示CD44-siRNA可有效地抑制胶质瘤细胞内CD44蛋白的表达。

与空白对照组比较，*P<0.05图4 空白对照组、阴性对照组及CD44-siRNA转染组CD44蛋白的表达Fig.4 Expression of CD44 in CON，NC and KD group

2.6 siRNA对胶质瘤细胞增殖的影响

CCK-8实验显示，CD44-siRNA转染组细胞的增殖能力明显低于阴性对照组和空白对照组(P<0.05)(图5)。

图5 转染siRNA-CD44后细胞的相对增殖活性(以1 d为基准)Fig.5 Cell relative proliferation ability after transfection of siRNA-CD44 (A450 nm on day 1 as base value)

2.7 siRNA对胶质瘤细胞体外侵袭能力的影响

Transwell小室的实验结果可明显看出，经siRNA-CD44处理后的U251细胞的穿膜细胞数量明显少于阴性对照组和空白对照组，提示CD44基因的表达下调使细胞的侵袭能力受到抑制(图6)。

2.8 siRNA对胶质瘤细胞凋亡的影响

流式细胞学分析结果显示，siRNA-CD44转染细胞72 h后，阴性对照组的凋亡率为4.11%，转染siRNA-CD44组的凋亡率为7.10%，二者差异有统计学意义(P<0.05)，见图7。

A：空白对照组；B：阴性对照组；C：转染组图6 Transwell小室穿膜细胞(结晶紫染色，×100)Fig.6 Transmembrane cells in transwell cell migration assay (crystal violet staining，×100)

A：流式细胞学检测结果；B：细胞凋亡率；与阴性对照组比较，*P<0.05图7 流式细胞术检测U251细胞凋亡Fig.7 U251 cell apoptosis tested by flow cytometry

3 讨论

CD44分子作为干细胞的标志，是一种分布广泛的细胞跨膜糖蛋白，参与细胞与细胞、细胞与细胞外基质相互识别和作用，可作为归巢受体参与淋巴细胞归巢或再循环，参与细胞的运动及细胞内外的信号传导等[4-7]。

多项研究显示CD44与肿瘤关系密切，可促进肿瘤细胞的增殖、侵袭、抗凋亡能力。Harn等[8]研究发现CD44的表达与胃癌的分化程度相关；Liu等[9]用免疫组化染色法发现CD44的高表达与细胞分化程度及肿瘤的侵袭转移密切相关。Patrawala等[10]研究发现CD44(+)前列腺癌细胞较CD44(-)细胞具有更强的克隆增殖能力、致瘤能力与转移能力；马丹等[11]研究发现肺腺癌细胞A549表达CD44，用RNAi技术可降低其表达，CD44低表达的A549细胞侵袭能力受到抑制。Yu等[12]在小鼠乳腺癌细胞中阻断CD44功能后，细胞丧失锚定MMP-9的作用，肿瘤细胞的侵袭和转移能力大大降低；进一步的机制研究显示CD44可与ErbB分子等邻近的跨膜受体酪氨酸激酶相结合而参与肿瘤细胞增殖[13]。CD44可作用于HER2分子而活化丝裂原蛋白激酶通路进而促进肿瘤细胞的增殖[14]。Ghatak等[15]研究提示，CD44可激活PI3K/Akt信号通路而增强肿瘤细胞的抗凋亡能力。CD44与脑组织及脑肿瘤关系也有报道[16-19]，Kaaijk等[16]利用免疫组化染色方法检测了人脑肿瘤冰冻标本发现CD44与肿瘤的恶性程度呈正相关。Ranuncolo等[17]在84例胶质瘤中检测发现CD44在不同级别的胶质瘤中均有表达，且与肿瘤的组织学分级有关。

近年来，大数据的概念不断充实和发展，我们试图通过对这些大数据的挖掘了解CD44在胶质瘤及正常脑组织的表达情况，以及对患者预后的影响。我们选择了目前世界上最大的基因芯片数据库Oncomine数据库，研究发现CD44在多种肿瘤，如结直肠癌、胃癌、黑色素瘤呈现高表达，少许几种肿瘤如子宫颈癌、卵巢癌、白血病中呈低表达。对10项研究的955例标本的荟萃分析显示，与正常脑组织相比，CD44在胶质瘤中显著高表达(P=1.73×10-8)。从中选取样本量较大的4项研究进行分析，CD44在胶质母细胞瘤、间变型星形细胞瘤、少突胶质瘤中的表达量均显著高于正常组织(均P<0.05)。通过R2基因可视化分析平台及TCGA数据库下载基因芯片数据分析发现，在胶质瘤中CD44高表达组患者的预后明显劣于低表达组。细胞水平的实验进一步验证了我们的结论，我们利用siRNA-CD44成功地抑制了CD44在胶质瘤细胞系U251中的表达，通过CCK-8试验、Transwell小室、流式细胞学细胞凋亡检测等发现，CD44表达下调使细胞的增殖、侵袭能力下降，细胞凋亡增加。

综上所述，我们通过对Oncomine基因芯片数据库中肿瘤相关基因进行分析，发现CD44在各级别胶质瘤中呈现高表达，且CD44高表达与患者较差的预后显著相关，抑制CD44的表达可抑制胶质瘤细胞的增殖、侵袭，促进细胞凋亡。CD44可作为胶质瘤的预后判断指标和潜在的药物治疗靶点。

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(2017-03-01 收稿)

Expression of CD44 and Its Prognostic Role in Glioma：Analysis Based on the Data-mining of Gene Database

Guo Qiuyun，Hu Guangyuan，Han Naetal

DepartmentofOncology，TongjiHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China

Objective To explore the expression of CD44 and its prognostic role in glioma and investigate the effects of CD44 downregulation on proliferation，invastion and apoptosis of glioma cells.Methods Data about CD44 were retrieved from the Oncomine database and the expression of CD44 in several kinds of tumor was analyzed.We probed the R2：Genomics Analysis and Visualization Platform to study the association of CD44 expression and overall survival(OS)of glioblastoma patients.Kaplan-Meier analysis of the prognosis of low grade glioma patients was performed on the data set downloaded from TCGA database.CD44-siRNA was transfected into U251 glioma cells to inhibit the expression of CD44.The proliferation，invasion and apoptosis of U251 cells was assessed by CCK-8 test，Transwell chamber and flow cytometry，respectively.Results Totally，467 studies about expression of CD44 in different types of tumors were identified in the Oncomine database.As compared with the normal tissues，the CD44 expression was statistically significantly different in tumors of 68 studies，upregulated in 51(10 in glioma)and downregulated in the other 17(none in glioma)studies.In 10 studies about glioma，CD44 expression was upregulated，and the 10 studies included 955 samples.Data from R2 platform(504 samples with glioblastoma)and TCGA database(529 samples with low grade glioma)showed that patients with high expression of CD44 were correlated with a worse OS.The 2-year survival rate was 13% and 25% for the high and low CD44 expression glioblastoma group，respectively(P=0.000 1).For low grade glioma，the 5-year survival rate was 47% and 61% for the high and low CD44 expression group，respectively(P=0.001 0).Moreover，the expression level of CD44 was reduced by CD44-siRNA in the U251 cells，the proliferation and invasion of U251 cells was inhibited，flow cytometry showed that the apoptosis rate was 7.10% and 4.11% for the CD44-siRNA transfection group and negative control group(allP<0.05).Conclusion CD44 is highly expressed in glioma and its expression is associated with the prognosis of glioma，which may be a promising therapeutic target for glioma.

glioma； CD44； Oncomine database； siRNA

*国家自然科学基金资助项目(No.81272780)

R739.4

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.03.001

郭秋云，女，1985年生，医学硕士，E-mail：Happyyun.1985@163.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：zhangmengxian@medmail.com.cn