UPLC-MS/MS检测乳品饮料中的四环素类残留

李婷婷，韦曙光，彭艳

（1.贵州民族大学化学与生态环境工程学院（民族医药学院），贵州贵阳550025；2.贵州省水利水电勘测设计研究院，贵州贵阳550001）

UPLC-MS/MS检测乳品饮料中的四环素类残留

李婷婷1，韦曙光2，彭艳1

（1.贵州民族大学化学与生态环境工程学院（民族医药学院），贵州贵阳550025；2.贵州省水利水电勘测设计研究院，贵州贵阳550001）

建立一种超高效液相色谱-串联质谱法检测乳品饮料中四环素、土霉素、金霉素、强力霉素残留的分析方法。样品前处理用乙腈沉淀蛋白后，采用HLB小柱进行净化和富集。采用Waters Atalantis T3色谱柱（2.1 mm×150 mm，3 μm）分离，以0.1%甲酸-乙腈为流动相的梯度洗脱模式下，4种四环素类抗生素在1.0 ng/mL～200.0 ng/mL浓度范围内线性良好，相关系数 r2为 0.998 5～0.999 2，检出限为 0.5 μg/kg～2.0 μg/kg，定量限为 1.5 μg/kg～6.0 μg/kg，加标回收率达到82.5%～91.5%。

超高效液相色谱-串联质谱；乳品饮料；四环素类

antibiotics

四环素类抗生素为广谱抗菌药，被广泛用作药物添加剂，用于预防和治疗畜禽疾病。随着动物源性食品需求的急剧增长，该类药物的滥用、超量使用、不遵守休药期规定等一系列不合理用药现象严重，导致动物源性食品中药物残留问题不断增多，已经涉及到乳及乳制品，对公众的健康带来潜在危害。

目前常用的四环素类抗生素有：四环素、土霉素、金霉素、强力霉素等，检测方法主要有微生物法、酶联免疫法、薄层色谱法、高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱-串联质谱联用法等[1-10]。但是已有的方法常有灵敏度不高，前处理繁琐、检测药物单一或重现性不好等问题，很难满足对药物残留的同时确证检测。本试验所用的方法结合了液相色谱的高分离能力和质谱提供结构信息的功能，具有灵敏度高、选择性强的优势。特别是在前处理阶段采用固相萃取技术，对于复杂样品的分析检测，不仅可以避免基质干扰等问题，而且可以起到一个富集目标物的作用，分析鉴定以往难于辨识的痕量成分。本方法针对4个四环素类药物建立了一种快速简便、专属性强、灵敏度高的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）方法，在实验室的推广可行性较高，可为乳品饮料中四环素类抗生素残留的监督检验和残留监控提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 1290超高效液相色谱仪：美国安捷伦公司；API4000四极杆串联质谱仪：美国AB公司。

四环素、土霉素、金霉素、强力霉素标准品：购于德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；HLB小柱、PEP小柱、C18小柱：规格 6cc，500 mg，Agilent公司。

1.2 超高效液相色谱条件

色谱柱：WatersAtalantisT3（2.1mm×150mm，3μm）；

流速：0.3 mL/min；进样量：10 μL；柱温：30 ℃；

流动相A为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈；流动相梯度洗脱程序：0～1.5 min 80%A；1.5 min～6 min 80%A →30%A；6 min～9 min 30%A →80%A；10 min 80%A。

1.3 方法

1.3.1 质谱条件的优化

质谱进样模式选用针泵连续进样，离子模式选择ESI+，先对4种抗生素类目标物进行母离子全扫描，再对4种抗生素类目标物子离子进行全扫描，分别选定4种目标物的定性离子和定量离子，并优化质谱的喷雾电压、离子源温度、碰撞气、扫描时间、去簇电压及碰撞电压等参数。

1.3.2 标准曲线的制作

称取一定量的四环素、土霉素、金霉素、强力霉素标准品，配制成浓度为 1.0、5.0、10.0、100.0、200.0 ng/mL的标准溶液，由超高效液相色谱仪进质谱仪分析，绘制相应的外标标准曲线。

1.3.3 样品前处理条件的优化

目标样品中含有较复杂的食品基质，前处理阶段要求既要除去杂质又要减少目标物的损失，所以对4种提取溶剂以及3种固相萃取小柱进行比较，选择较优的前处理条件。

1.3.4 加标回收试验及样品测定

在空白基质中加入4种目标物的标准溶液，选择优化后的前处理条件和质谱条件，上机检测，计算回收率。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

质谱进样模式选用针泵连续进样，离子模式选择ESI+，分别对浓度为500 ng/mL的四环素、金霉素、土霉素、强力霉素的标准溶液进行母离子全扫描，确定其分子离子，优化各母离子的去簇电压和锥孔电压。再在上述条件的基础上，对其子离子进行全扫描，选择各自两组丰度最高的离子，较高一个作为定量离子，另一个作为定性离子，并对质谱检测的喷雾电压、离子源温度、碰撞气、扫描时间、去簇电压及碰撞电压等参数进行优化。

优化后的质谱条件为：喷雾电压5 000 V、离子源温度550℃、氮气流量25 L/min、扫描时间50 ms，其他质谱参数见表1。

表1 4种四环素类的多反应监测扫描模式的质谱参数Table 1 Mass spectrometric parameters for 4 tetracycline antibiotics

依照表1优化后的条件，质谱选择多反应监测模式（MRM）进行检测，4种四环素类抗生素能在10 min内快速分离，结果如图1所示。

2.2 标准曲线的制作

为了验证四环素、金霉素、土霉素、强力霉素等4种目标物在仪器中的线性关系，准备了浓度为1.0、5.0、10.0、100.0、200.0 ng/mL 5 个梯度的系列混合标准溶液，将其上机进行检测。

试验结果如表2所示，4种抗生素在1.0 ng/mL～200.0 ng/mL范围内具有良好的线性关系，r2在0.998 5～0.999 2之间，线性关系良好，4种目标物的检出限在0.5 μg/kg～2.0 μg/kg 之间，定量限在 1.5 μg/kg～6.0 μg/kg之间。

2.3 提取溶液的优化

在对四环素、土霉素、金霉素、强力霉素等4种四环素类抗生素提取的过程中，4种抗生素易被乳品饮料中的蛋白质所吸附，所以在前处理过程中既要考虑蛋白质的去除也要避免目标成分被蛋白质沉淀所吸附。本试验参考相关文献[11-14]，比较了5%盐酸、甲醇、乙醇、乙腈等4种提取溶液对4种目标物的提取效果。

图1 4种四环素类的MRM图Fig.1 MRM chromatogram of 4 tetracycline antibiotics

表2 4种四环素类抗生素的保留时间、标准曲线、相关系数、检出限与定量限Table 2 Retention time，standard curve，correlation coefficient，detection limit and quantitative limit of 4 tetracycline antibiotics

图2 提取溶液对4种四环素类平均回收率的影响Fig.2 The effect of extract solution on the average recovery rate for the four kinds tetracycline antibiotics

结果如图2所示，4种提取溶剂中，当5%盐酸作为提取溶剂时，乳品饮料中的蛋白质沉淀不充分，提取液出现浑浊现象；当甲醇、乙醇以及乙腈为提取溶剂时，乳品饮料中的蛋白质沉淀效果明显，提取液易于分离，其中乙腈的提取效果最好，回收率最高，所以本试验选择乙腈作为提取溶液。

2.4 固相萃取柱的选择

乳品饮料中的基质成分复杂，即使是经乙腈提取后的提取液中也含有很多杂质干扰目标物在仪器上的响应。所以本试验采用固相萃取小柱对提取液进行进一步的净化和富集，并比较了常用的硅胶小柱、中性氧化铝小柱、PEP固相萃取柱、HLB小柱以及C18小柱等5种固相萃取小柱对4种目标物的净化效果，结果以4种目标物的平均加标回收率作为比较依据。

结果发现，相比较其他几款小柱，HLB小柱对样品提取液的净化效果最好，加标回收率最高。主要是因为HLB小柱属于通用型吸附剂，其吸附容量较高，吸附性较强，对基质的净化效果较好，目标物受杂质的干扰较小，所以选择HLB小柱作为乳品饮料提取溶液的净化和富集的小柱。

2.5 加标回收与相对偏差

在上述优化后的前处理条件和仪器条件下，往空白基质中加入4种目标组分的标准溶液进行加标回收率试验，分别添加 1.0、2.0、10.0 μg/kg等系列浓度的标准溶液，每个结果测定3次。

表3 方法的回收率及相对标准偏差（n=3）Table 3 Recoveries and relative standard deviations（RSD）of the method（n=3）

由表3可见，4种目标组分的加标回收率在82.5%～91.5%之间，RSD在1.8%～3.1%之间，说明本试验的检测数据的准确度和精密度可行。

2.6 实际样品的测定

利用本试验优化后处理方法及检测方法，对市场上随机购买的30个批次乳品饮料进行测定，结果良好，未发现上述4种抗生素药物残留。并且对30个批次样品利用标准GB/T 22990-2008《牛奶和奶粉中四环素、土霉素、金霉素、强力霉素残留量的测定液相色谱-紫外检测法》[15]进行复检，结果也良好，未检测出阳性样品，表明该方法可行，可用于实际样品的测定。

3 结论

本试验建立一种超高效液相色谱-串联质谱检测乳品饮料中四环素、土霉素、金霉素、强力霉素药物残留的分析方法。结果表明，通过优化后的质谱条件，在MRM扫描模式下，4种抗生素组分能在10 min实现快速的分离和检测。乳品饮料经过乙腈溶液提取沉淀后，提取液再经HLB固相萃取小柱净化和富集后，可有效去除样品中的复杂基质，可实现样品中4种目标组分的分离，能准确快速有效地检测乳品饮料中的四环素、土霉素、金霉素、强力霉素的残留分析。

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[15]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局,中国国家标准化管理委员会.GB/T22990-2008牛奶和奶粉中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定液相色谱-紫外检测法[S].北京:中国标准出版社,2008

Analysis Tetracycline Antibiotics Residues in Dairy Beverage by UPLC-MS/MS

LI Ting-ting1，WEI Shu-guang2，PENG Yan1
（1.School of Chemistry and Eco-Environmental Engineering（School of Chinese Pharmacy），Guizhou Minzu University，Guiyang 550025，Guizhou，China；2.Guizhou Survey&Design Reserch Institute for Water Resources and Hydropower，Guiyang 550001，Guizhou，China）

A ultra high performance liquid chromatography mass spectrometry analysis method was established for the residues determination of tetracycline，oxytetracycline，chlortetracycline and doxycycline in dairy beverage.After the sample was treated with acetonitrile，it was concentrated and purified by HLB solid phase extraction column.The separation of target compound was performed on a Waters Atalantis T3 chromatographic column（2.1 mm × 150 mm，3 μm）using 0.1%formic acid-acetonitrile as mobile phase under gradient elution mode.The linear range of 4 tetracycline antibiotics components was in the range of 1.0 ng/mL-200.0 ng/mL with a correlation coefficient of 0.998 5-0.999 2.The detection limit was 0.5 μg/kg-2.0 μg/kg and the quantitative limit was 1.5 μg/kg-6.0 μg/kg.The recovery rate was 82.5%-91.5%.

ultra high performance liquid chromatography mass（UPLC-MS/MS）；dairy beverage；tetracycline

2017-02-10

李婷婷（1985—），女（布依），实验师，硕士，研究方向：分析化学、环境监测；环境化学。

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.13.039