HPLC-ELSD法检测葛根酶解物中纤维低聚糖的含量

王朋凯，张雁，唐小俊，池建伟

（1.华中农业大学食品科学技术学院，湖北武汉430070；2.广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所/农业部功能食品重点实验室/广东省农产品加工重点实验室，广东广州510610）

HPLC-ELSD法检测葛根酶解物中纤维低聚糖的含量

王朋凯1，2，张雁2，*，唐小俊2，池建伟2

（1.华中农业大学食品科学技术学院，湖北武汉430070；2.广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所/农业部功能食品重点实验室/广东省农产品加工重点实验室，广东广州510610）

建立高效液相色谱-蒸发光检测器（High Performance Liquid Chromatography-Evaporative Light Scattering Detection）测定葛根酶解制备物中葡萄糖、纤维二糖和纤维三糖的方法。HPLC条件为：采用Asahipak NH2P-50-4E（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，柱温 35℃、流动相：乙腈 ∶水=70∶30（体积比）、流速 0.8 mL/min；ELSD 参数为：漂移管温度70℃，N2流速2.0 L/min。结果表明，葡萄糖、纤维二糖和纤维三糖的浓度与其峰面积在0.07 mg/mL～0.7 mg/mL内有良好的线性关系（R2＞0.99），精密度RSD 0.99%～3.1%，平均回收率98.17%～103.42%。

高效液相色谱；蒸发光检测器；葛根纤维低聚糖

葛根是传统药食两用植物，采自豆科葛属植物的根，富含黄酮、淀粉、膳食纤维等活性成分，从中提取的黄酮和淀粉在医药及食品工业中得到了较好的应用[1]，而含有大量膳食纤维的副产物葛根残渣多作为废料丢弃，造成一定程度的资源浪费。实际上，葛根膳食纤维中的纤维素经过酶水解可制备功能性纤维低聚糖。

纤维低聚糖是由2到10个葡萄糖通过β-1，4糖苷键连接而成的线性低聚糖，具有促进双歧杆菌增殖、提高机体免疫力、抗龋齿、促进钙、磷、镁等对矿物质的吸收和预防结肠癌等功能[2-3]，可应用于营养保健、畜牧兽医、饲料和医药等领域。因此，将葛根膳食纤维转化为纤维低聚糖，既可提高资源利用率，又可提升其经济社会效益。

确定葛根纤维低聚糖的定量分析方法，对于葛根纤维低聚糖酶解制备工艺参数的优化尤为关键。目前纤维低聚糖的测定方法主要包括蒽酮比色法、苯酚硫酸法、高效液相色谱法、气相色谱法等[4]。其中高效液相法测定糖类物质的含量最为快捷简便，且无需衍生化处理，尤其是定量单糖及低聚糖的效果较好。蒸发光检测器是近年来广泛应用于糖类测定的通用型质量检测器，它基于不挥发性样品颗粒对光的散射程度与其质量成正比的原理进行检测，对没有紫外吸收、荧光或电活性的物质以及产生末端紫外吸收的物质均能产生响应[5-6]。具有灵敏度高、容许梯度洗脱、不易受环境影响等优点[7]。

本试验采用高效液相-蒸发光散射检测器联用，建立葛根酶解制备物中葡萄糖、纤维二糖和纤维三糖的定量分析方法，以期为葛根纤维低聚糖的制备技术开发及应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

Aligent 1200高效液相色谱、Aligent 1260蒸发光检测器：美国安捷伦公司；Asahipak NH2P-50-4E（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱：日本昭和公司；电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；离心机：Thermo美国；SB25-12 DTD超声清洗机：宁夏新芝生物科技股份有限公司。

1.2 材料与试剂

葛根：广州市天河区天平架果蔬批发市场，产地广东，品种为粉葛，新鲜度和成熟度良好；纤维素酶（别名 β-1，4（1，3）内切葡聚糖酶，酶活力 0.8 U/mg）、葡萄糖（纯度≥99%）、纤维二糖（纯度≥99%）、纤维三糖（纯度≥99%）标准品：美国希格玛有限公司；乙腈为色谱纯、其他试剂为分析纯、试验用水为超纯水：美国费希尔有限公司。

1.3 色谱条件及检测器参数

HPLC参数：AsahipakNH2P-50-4E色谱柱（4.6mm×250 mm，5 μm），柱温 35 ℃，流速 0.8 mL/min，进样量10 μL；ELSD参数：蒸发温度70℃，漂移管温度70℃，载气流速2.0 L/min，增益1。

1.4 方法

1.4.1 流动相体系对糖色谱行为的影响

流动相流速0.8 mL/min，柱温35℃，配置不同比例的流动相：乙腈∶水=75∶25（体积比）、乙腈∶水=70∶30（体积比）、乙腈 ∶水=60∶40（体积比），考察不同比例的流动相对3种糖分色谱行的影响。

1.4.2 标准溶液的配置

3种糖标准贮备液：分别准确称取0.050 0 g葡萄糖、纤维二糖、纤维三糖标准品溶于少量超纯水中，转移至10 mL容量瓶，加水定容，得5 mg/mL葡萄糖、纤维二糖和纤维三糖标准贮备液。

3种糖混合标准液：分别吸取上述3种糖液的标准贮备液2 mL于10 mL容量瓶中混合，用超纯水定容，得1 mg/mL 3种糖混合标准溶液，转移至试剂瓶，吸取部分混合标准溶液，使用超纯水稀释为0.7 mg/mL的标准工作液备用。

1.4.3 葛根膳食纤维提取

将清洗干净的新鲜葛根切块打浆，并用砂布过滤浆液，浆液自然沉降、干燥后得到葛根淀粉以备其他用途；滤渣进行脱蛋白处理，得到葛根膳食纤维粗品，经80℃烘干后粉碎备用。

1.4.4 葛根纤维低聚糖样品制备

将粉碎后的葛根膳食纤维加入柠檬酸缓冲液，配制成4%的悬浊液，然后添加适量的纤维素酶，置于磁力搅拌器上酶解一段时间，反应结束后沸水灭酶15 min，将酶解液进行真空抽滤，滤液离心15 min，取适量稀释后的上清液，过0.22 μm滤膜，得样品溶液。

1.4.5 标准曲线的绘制

以0.7 mg/mL的标准工作液为基准，通过改变高效液相的上样量（5、15、25、35、45、50 μL），按 1.3 项色谱条件上机测定，以峰面积Y对3种标准物质量浓度（mg/mL）X计算线性回归方程，得到线性范围。

1.4.6 精密度

取混合标准溶液，按照1.3的色谱条件重复进样6次，计算混合标准溶液中葡萄糖、纤维二糖和纤维三糖峰面积的相对标准偏差（RSD），以峰面积的相对标准偏差表示测定方法的精密度。

1.4.7 检出限、定量限

将葡萄糖、纤维二糖和纤维三糖3种糖的混合标准溶液稀释后进行测定，在信噪比S/N约为3时测得最低检出限；在信噪比S/N约为10时测得最低定量限。

1.4.8 重复性

取同一样品溶液，按照1.3的色谱条件测定，进行5次重复，计算样品中葡萄糖、纤维二糖和纤维三糖峰面积的相对标准偏差（RSD），以峰面积RSD表示测定方法的重复性。

1.4.9 稳定性

取同一样品溶液分别在室温下放置 0、2、4、6、8、10 h后进样分析，并计算样品中葡萄糖、纤维二糖和纤维三糖的峰面积相对标准偏差（RSD），以峰面积RSD表示测定方法的稳定性。

1.4.10 加标回收率

采用添加标准样法测定回收率，对样品提前加入3 mg/mL的糖标准溶液2 mL，以不加标准物质的样品作为对照，重复测试5次，根据加标量与检出量计算样品回收率。回收率/%=检出量/加标量×100。

1.4.11 样品溶液各组分含量的测定与计算

将制备完成的葛根纤维低聚糖样品溶液按照1.3的色谱条件进样分析，采用外标法，根据峰面积计算样品中葡萄糖、纤维二糖及纤维三糖等各个组份的含量。

2 结果与分析

2.1 色谱柱的选择

糖类物质的色谱分析通常使用氨基柱，然而传统硅胶基质的氨基柱寿命较短，不耐水相，当流动相中水相比例大于40%时，硅胶基质氨基柱的键合相易脱落，从而发生基线漂移，无法定量的情况[9]。本试验选取的色谱柱为聚乙二醇基质的氨基柱，克服了传统氨基柱不耐水相，使用寿命短，基线漂移的弱点[8]，可以有效测定葛根酶解制备物中葡萄糖、纤维二糖和纤维三糖的含量，重复性良好，同时可以得到较好的分离度和峰形。

2.2 流动相比例的确定

根据糖分子含有极性基团及氨基柱的特点，选用乙腈和水作为流动相。结果如图1所示，适当降低乙腈的比例可以明显缩短各峰的保留时间，当乙腈和水的体积比为75∶25时，各组分峰分离较好，但保留时间较长；当乙腈和水的体积比为70∶30时，各组分峰分离度良好，在20 min内完全分离；但当乙腈与水的体积比降低到60∶40时，流动相的极性增加较大，各组分峰却难以分离。

因此，选择乙腈∶水=70∶30（体积比）作为本方法的流动相。

图1 不同比例乙腈∶水作流动相时的混合糖标准品色谱图Fig.1 Chromatograms of mixed standard samples with different volume ratio of CH3CN and H2O as mobile phase

2.3 柱温和流速的选择

在乙腈∶水=70∶30（体积比）做流动相的条件下，分别设置柱温为30、35、40℃进行试验，结果表明上述3个温度对3种糖的分离效果影响并不大，考虑到色谱柱的温度适用范围，选择柱温为35℃；流动相流速在一定程度上决定保留时间的长短，随着流动相流速的增加，保留时间减小，但当流速过高时，会导致色谱柱的柱压偏高，有损色谱柱的使用寿命，所以本实验采用流速0.8 mL/min。

2.4 色谱检测条件的选择

载气流速和漂移管温度是ELSD检测器二个关键的技术参数。当载气流速过低时，形成大量微滴，导致尖峰信号或噪声信号；载气流速过高时，微滴量过低会导致信号响应降低。而漂移管温度下降时，溶剂挥发不完全；但当温度过高时，分析样品部分挥发，微滴量下降，检测器响应下降[10-11]。因此，选择载气流速为2.0 L/min，漂移管温度为70℃。

2.5 检测方法的标准曲线、线性范围

检测方法的标准曲线、线性范围如表1所示。

表1 3种糖的线性关系、相关系数和精密度Table 1 The linear equation，correlation coefficient and precision of 3 saccharides

2.6 方法的精密度

混合标准工作液中葡萄糖、纤维二糖和纤维三糖的峰面积RSD结果见表1。三种糖的精密度0.99%～3.1%，表明该检测方法精密度良好。

2.7 方法的检出限和定量限

混合标准工作液中葡萄糖、纤维二糖和纤维三糖的检出限分别为 1.61、0.83、2.52 μg；定量限分别为5.06、2.17、8.02 μg。

2.8 方法的重复性

检测方法的重复性试验结果如表2所示，3种糖的峰面积RSD 2.4%～3.1%，说明该检测方法的重复性良好。

表2 重复性试验结果Table 2 Repetitiveness of the method

2.9 方法的稳定性

检测方法的稳定性试验结果见表3。

表3 稳定性试验结果Table 3 Steadiness of the method

葛根纤维低聚糖样品在室温下分别放置0、2、4、6、8、10 h后，其测定的峰面积 RSD2.5%～3.3%，说明该方法的稳定性较好。

2.10 加标回收率试验

加标回收率是实验室确定准确度的重要指标之一，同时也可反应分析方法是否适合被测样品。加标回收率试验见表4。

表4 加标回收率试验Table 4 Recovery rate of the established method

从表4可知，样品的平均加标回收率98.17%～103.42%，回收率RSD 2.81%～3.90%，说明该检测方法准确性较高。

2.11 样品测定

葛根酶解制备物中纤维低聚糖含量的确定是衡量检测方法有效性最直接指标。将制备完成的样品按照1.3项色谱条件进样分析，结果见图2。

样品中葡萄糖、纤维二糖和纤维三糖的含量分别为（1.330±0.042）mg/mL（样品浓度 RSD=3.158%）、（2.805±0.063）mg/mL（样品浓度 RSD=2.246%）和（0.580±0.035）mg/mL（样品浓度 RSD=6.035%）。

图2 葛根纤维低聚糖酶解样品HPLC色谱图Fig.2 The HPLC chromatogram of the samples

3 讨论与结论

在糖类物质检测方法中，常见的苯酚-硫酸法、二硝基水杨酸法等化学分析法用于测定总糖，其中苯酚硫酸法不稳定，重复性不好，易受环境因素的影响[12]；气相色谱法因其在糖类物质测定上具有选择性好、样品用量少、分辨率高、快速准确等优点，在国内外得到广泛应用。但气相色谱法测定的样品需具有一定的挥发性，而糖类物质的挥发性较少，需要衍生化处理，费时繁琐[4]。

高效液相法测定纤维低聚糖较为简便快捷，而通常采用的示差折光检测器，对于温度变化及其敏感，使得基线变化很不稳定，灵敏度低，且启用前需使用流动相长时间平衡检测器[13]；刘胜男等[14]采用高效阴离子脉冲安倍检测器可准确测定纤维低聚糖的含量，但该类检测器对技术设备要求较高，价格昂贵[15]。

蒸发光检测器是近年来广泛应用于糖类测定的通用型质量检测器，样品无需衍生化处理、检测灵敏度高，对物质的响应不依赖于样品的光学特性，可以有效克服示差折光检测器基线漂移、不容许梯度洗脱的弱点，有利于浓度较小的低聚糖及单糖的测定。Xi Chen[16]、YA Sun[17]、闫正[18]等先后使用 HPLC-ELSD 方法准确测定啤酒、烟草和乳制品中的可溶性糖含量，分离度好且峰形较佳。

本研究建立了葛根酶解物中葡萄糖、纤维二糖和纤维三糖的色谱分离条件：采用Asahipak NH2P-50-4E（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，柱温 35 ℃、流动相：乙腈 ∶水=70∶30（体积比）、流速 0.8 mL/min；漂移管温度70℃，N2流速2.0 L/min，增益值：1。葡萄糖、纤维二糖和纤维三糖的浓度与其峰面积在0.07 mg/mL～0.7 mg/mL内有良好的线性关系，样品平均回收率98.17%～103.42%，其RSD为 2.81%～3.90%，方法精密度0.99%～3.1%，重复性和稳定性良好，样品检测的峰面积RSD＜3.5%，可为纤维低聚糖的检测和应用提供依据。

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Determination of Cello-Oligosaccharide in Radix Puerariae Enzymatic Preparation by HPLC-ELSD

WANG Peng-kai1，2，ZHANG Yan2，*，TANG Xiao-jun2，CHI Jian-wei2
（1.College of Food Science and Technology，Huazhong Agriculture University，Wuhan 430070，Hubei，China；2.Sericultural&Agri-Food Research Institute of Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Functional Foods，Ministry of Agriculture/Guangdong Key Laboratory of Agricultural Products Processing，Guangzhou 510610，Guangdong，China）

A high performance liquid chromatography （HPLC）with evaporative light scattering detection（ELSD）method was developed for the dermination of 3 saccharides such as glucose，cellobiose and cellotriose in the enzymatic hydrolysate of Radix Puerariae.A Asahipak NH2P-50-4E（4.6 mm×250 mm，5 μm）column was used and the HPLC contidions were as follows：colunmn temperature 35 ℃，mobile phase：acetonitrile：water=70∶30，flow rate 0.8 mL/min.And also the ELSD conditions were：detector drift tube temparature 70℃，nitrogen flow rate 2.0 L/min.The results showed that there were good linear correlations between the concentration and the peak area of the 3 kinds of saccharides with the detection limitation from 0.07 mg/mL to 0.7 mg/mL（R2＞0.99）.Precision RSDs of standard samples for the determination of the sugars were 0.99%-3.1%and average recoveries for the sugars in 5 real samples were 98.17%-103.42%.

high performance liquid chromatography（HPLC）；evaporative light scattering detection（ELSD）；Radix Puerariae cello-oligosaccharides

2017-03-12

广东省工业高新技术项目（2013B010102011）；广州市产学研协同创新重大专项（201508020036）；广东省应用型科技研发专项（2015B020230005）

王朋凯（1994—），男（汉），硕士，研究方向：食品生物化学。

*通信作者：张雁（1967—），女（汉），研究员，博士，研究方向：食品生物化学。

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.13.030