运动营养品中磺胺类成分的残留检测

陶弥锋

（江西科技学院体育部，江西南昌330029）

运动营养品中磺胺类成分的残留检测

陶弥锋

（江西科技学院体育部，江西南昌330029）

建立一种用高效液相色谱法测定运动营养品中9种磺胺类成分残留的检测方法。样品经乙醇提取后，过固相萃取柱后上机检测。采用ZORBAX SB C18分析色谱柱分离，以甲醇-1.0%甲酸作为流动相的梯度洗脱模式下，外标法峰面积定量。结果表明，9种组分在0.05 μg/mL～10.00 μg/mL浓度范围内线性良好，相关系数r2为0.999 0～0.999 8，检出限在 10 μg/kg～15 μg/kg，定量限在 30 μg/kg～45 μg/kg，加标回收率达到 79.2%～84.7%。

高效液相色谱；运动营养品；磺胺类药物

运动员和从事健身运动的人对多种营养素如碳水化合物、蛋白质、维生素、无机盐、水等的需要都要高于不从事运动的人。在膳食营养不能满足机体的需求时，这些营养素补充剂就成了不可缺少的营养品。其中蛋白质的补充在运动队以及健身人群，乃至于一般人群中越来越流行。而蛋白质补充剂多数是由牛奶以及动物组织制成，然而随着磺胺类药物在动物饲养上的滥用，建立以含动物性蛋白为基质的运动营养品中磺胺类残留的检测方法十分必要，特别是对运动员这类特殊人群来说，评价此类食品的安全具有重要意义。

磺胺类物质是对氨基苯磺酸的衍生物，其分子中含有苯环、对氨基（N4）和磺酰胺基，如图1所示，各种化学基团取代R基而形成大量有效的衍生物。磺胺类药物是饲养动物时广泛使用的一类广谱抗菌性药物，能引起过敏反应、排尿和造血紊乱等副作用。欧盟将磺胺类药物列为必须严格限制使用的药物，并规定动物源食品中磺胺类药物的最大残留限量为0.1 μg/g，我国颁布的《动物性食品中兽药最高残留限量》（农业部235号公告）中明确规定所有动物性食品中磺胺类药物的残留不得超过100 μg/kg[1-3]。

图1 磺胺类药物的结构式Fig.1 Structure of sulfanilamide

目前检测磺胺类药物的方法主要有气相色谱法（GC）[4-5]、高效液相色谱法[6-8]、液-质联用法（LC/MS）[9-10]等。GC法需要烦琐的衍生化步骤，样品前处理复杂，不适合批量样品的分析，其应用受到了限制。LC/MS法是近年来发展起来的一种新的方法，具有定性准确、灵敏度高等特点，但由于仪器昂贵而不能在普通实验室推广。HPLC法是目前在普通实验室广泛使用的检测方法，比较适合普及。本研究建立了一种可同时检测运动营养品中9种磺胺类药物的高效液相色谱法，对净化和色谱分离条件进行了优化，考察了方法的检出限、回收率和线性范围等，获得了良好的分析结果。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

2695型高效液相色谱系统、2998型配二极管检测器：美国Waters公司；RE-52A旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂。

磺胺类药物标准品（磺胺嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺二甲嘧啶、磺胺硝苯、磺胺吡啶、磺胺喹恶琳、磺胺二甲氧哒嗪、磺胺噻唑、磺胺多辛）：Sigma公司；乙腈、甲醇均为色谱纯：美国Fisher Scientific公司。

1.2 样品来源

样品均为随机购买市场上销售的运动营养品。

1.3 色谱条件

流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL；柱温：30 ℃；检测波长：246 nm。

1.4 方法

1.4.1 色谱柱的选择

本试验比较了常用的3种色谱柱对9种磺胺类药物的分离度和检测灵敏度的影响。

1.4.2 流动相体系对磺胺类药物色谱行为的影响

依据磺胺类药物结构中都含有氨基，具有弱碱性，流动相中的酸度对磺胺类药物在色谱柱上的分离会有很大的影响。本试验考察不同pH值的流动相体系以及洗脱模式对磺胺类药物在色谱柱上分离效果的影响。

1.4.3 标准曲线的制作

称取相应质量的9种磺胺类药物标准品，配制成浓度为 0.05、0.10、1.00、2.00、5.00、10.00 μg/mL 的标准溶液，进行仪器分析，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。

1.4.4 样品前处理条件的优化

运动营养品中除了固有的一些食品基质外，还含有很多人为添加的营养元素，成分复杂，对前处理要求高，所以本试验样品前处理对4种不同的提取溶剂进行比较后，选用固相萃取柱对提取液进行净化，并对常用的固相萃取柱对比净化效果，选用合适的固相萃取小柱，结果以样品加标平均回收率为比较依据，制定较优的前处理条件。

1.4.5 加标回收试验

以市场上随机购买的运动营养品为基质，加入9种磺胺类药物的混标溶液，选择优化后的前处理条件操作，上机检测，计算回收率。

2 结果与讨论

2.1 色谱柱的选择

根据磺胺类药物的性质，本试验就常用的ZORBAX SB C18、Eclipse Plus C18和 Extend C18等 3 种色谱柱对9种磺胺类药物的分离度和检测灵敏度进行比较。试验结果表明，ZORBAX SB C18色谱柱更适合分析9种磺胺类药物，虽然色谱柱Eclipse Plus C18分析时用时更短，但不能将每种磺胺类药物很好的分离以及有良好的峰形，在粒径相同的情况下，采用ZORBAX SB C18色谱柱，能在合理的时间（30 min）内获得良好的分离度。

2.2 流动相体系对磺胺类药物色谱行为的影响

参考相关的标准和文献，比较了4种pH值流动相体系对目标物的分离效果：Ⅰ甲醇-0.1%甲酸、Ⅱ甲醇-0.5%甲酸、Ⅲ甲醇-1.0%甲酸、Ⅳ甲醇-2.0%甲酸。试验结果发现，当甲酸浓度超过1.0%时，体系中甲酸浓度的变化对于磺胺类药物的分离影响较小，因此本试验中流动相体系采用1.0%的甲酸作为水相。

在调节有机相甲醇的相对含量时发现，甲醇的相对含量变化对磺胺类药物的分离影响较大。当甲醇比例太少时，磺胺类物质洗脱太慢，导致的分离时间过长；当甲醇比例过高时，磺胺类物质的挂柱时间太短，导致目标物的分离度不够。所以为了使磺胺类药物均达到有效的分离，本试验经过摸索，在甲醇-1.0%甲酸的流动相体系下选择梯度洗脱模式，洗脱条件见表1，9种目标物能得到了很好的分离，未发现干扰峰，峰型尖锐且对称，如图2所示。

表1 甲醇-1.0%甲酸为流动相的梯度洗脱条件Table 1 The gradient elution mode by methano-1.0%formic acid as mobile phase

图2 9种磺胺类药物色谱图Fig.2 The chromatogram of nine sulfonamides standards

2.3 标准曲线的制作

为了验证9种磺胺类药物在甲醇-1.0%甲酸的流动相体系中的线性关系，配制了9种目标物的标准混合溶液，浓度分别为 0.05、0.10、1.00、2.00、5.00、10.00μg/mL。试验结果表明，9种目标物在0.05 μg/mL～10.00 μg/mL 内均具有良好的线性关系（r2＞0.99）；采用在空白基质中添加目标组分的方法，依据色谱峰的信噪比（S/N）大于3倍确定检出限（LOD），S/N大于10倍确定定量限（LOQ），得到9种目标组分的LOD和LOQ分别为 10 μg/kg～15 μg/kg 和 30 μg/kg～45 μg/kg，结果见表2。

2.4 前处理过程的优化

参考相关文献，针对于样品提取液的选择，分别选用丙酮、二氯甲烷、乙醇、乙腈等4种溶剂来进行比较，分别称取10.0 g试样于50 mL具塞塑料离心管中，加入提取液定容至刻度，高速均质2 min后过滤。

由于运动营养品中的基质比较复杂，要同时分析多种磺胺药物残留，仅仅靠提取溶剂的分离很难去除样品中的干扰物和杂质，因此本试验比较了常用的几种固相萃取小柱对提取液的净化效果，选择净化效果较优的固相萃取小柱进行试验，结果以样品加标的平均回收率进行比较。

表2 9种磺胺类药物的保留时间、标准曲线、相关系数、检出限与定量限Table 2 Retention time，standard curve，correlation coefficient，detection limit and quantitative limit of nine kinds of sulfanilamide

结果如图3所示，用丙酮和二氯甲烷作为提取液中，磺胺类药物的回收率很低；乙腈和乙醇的提取效率高，但是磺胺类药物的耐热性差，而乙腈的沸点高，从而对浓缩带来很大的困难。而且乙醇作为提取液在经固相萃取柱净化后不存在干扰，所以本试验选择乙醇作为样品的提取溶剂。

图3 提取液对9种磺胺类药物平均回收率的影响Fig.3 The effect of extract solution on the average recovery rate for the nine kinds of sulfanilamide

常用来净化磺胺类药物的固相萃取柱有C18小柱、HLB小柱、硅胶小柱、碱性氧化铝小柱、SCX小柱和氨基小柱等，其中以C18小柱和HLB小柱最为常用且为反相色谱保留机制。从磺胺类药物结构可知，磺胺类是一类弱碱性的药物，C18固相萃取小柱和HLB小柱理论上都适合磺胺类药物的净化，其中C18固相萃取柱主要填充物带疏水基团，适用于中等极性到非极性化合物的净化。HLB固相萃取小柱的填充材料是二乙烯苯-N-乙烯基吡咯烷酮聚合物具有亲脂亲水性，而且柱子不怕抽干，碳链不会塌陷。经对C18小柱和HLB小柱的加标回收试验发现，HLB固相萃取小柱净化效果更好、回收率更高、操作要求比C18固相萃取小柱更低，方法更容易重复，所以本研究采用HLB小柱对样品进行净化。

2.5 样品的测定及加标回收

在市场上购买的20个批次的运动营养品中，根据2.4试验结果选择优化后仪器条件和处理条件，选择乙醇作为提取溶剂，然后经HLB小柱净化后上机检测。9种磺胺类药物的回收率和精密度试验见表3。

表3 9种磺胺类药物的回收率和精密度试验（n=5）Table 3 Precisions and recovery rates of nine kinds of sulfonamides（n=5）

结果表明：在所检测的运动营养品中，暂未检出磺胺类药物的残留。在样品的加标回收试验中，9种目标物的加标回收率在79.2%～84.7%之间，符合检测要求。

3 结论

本文建立了一种高效液相色谱法检测运动营养品中9种磺胺类药物残留的分析方法。结果表明，在甲醇-1.0%甲酸流动相体系梯度洗脱的条件下，9种目标物能得到良好的基线分离，其峰型良好，出峰时间合适。样品在经乙醇提取液的提取后，经HLB固相萃取小柱可实现对目标物的净化，准确有效地检测运动营养品中的磺胺类药物的残留。

[1]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.GB/T 18932.5-2002蜂蜜中磺胺醋酰、磺胺吡啶、磺胺甲基、嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺甲基异噁唑、磺胺二甲氧嘧啶残留量的测定方法液相色谱法[S].北京:中国标准出版社,2003

[2]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.GB/T 18932.17-2003蜂蜜中16种磺胺残留量的测定方法液相色谱-串联质谱法[S].北京:中国标准出版社,2004

[3] 段振娟,张鸿雁,王硕.动物性食品中磺胺类药物残留分析研究进展[J].食品研究与开发,2007,28(6):149-152

[4]ARROYO-MANZANARES N,GÁMIZ-GRACIA L,GARCÍACAMPANˇAA M.Alternative sample treatments for the determination of sulfonamides in milk by HPLC with fluorescence detection[J].FoodChemistry,2014,143:459-464

[5]FRENICH A G,AGUILERA-LUIZ M M,VIDAL J L M,et al.Comparison of several extraction techniques for multiclass analysis of veterinary drugs in eggs using ultra-high pressure liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].Analytica Chimica Acta,2010,661(2):150-160

[6] 陈振桂,占春瑞,郭平.高效液相色谱法同时测定水产品中13种磺胺类药物残留的研究[J].食品科学,2007,28(10):448-450

[7] 张艳,吴银良.固相萃取-高效液相色谱法测定动物肉组织中磺胺类药物的残留[J].色谱,2005,23(6):636-640

[8] 余辉菊,杨晓松.HPLC基质固相分散-高效液相色谱法测定牛奶中8种磺胺类药物残留[J].中国卫生检验杂志,2009,19(1):86-89

[9] 郭黎明,朱奎,江海洋.超高效液相色谱-串联质谱法同时测定鸡肝中残留的四环素类、磺胺类和喹诺酮类药物[J].色谱,2009,27(4):412-415

[10]李娜,张玉婷,刘磊,等.QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法测定动物源食品中4类29种禁限用兽药残留[J].色谱,2014,32(12):1313-1319

Determination of Sulfanilamide Residue in Sports Nutrition

TAO Mi-feng
（Department of Sports，Jiangxi University of Technology，Nanchang 330029，Jiangxi，China）

A rapid and effective method was established for the determination of nine kinds of sulfanilamide residue in sports nutrition by high performance liquid chromatography method.The samples were extracted by ethanol，and detected after purified by solid phase extraction column.The separation of target compound was performed on a ZORBAX SB C18chromatography column using methanol-1.0%formic acid as mobile phase by the gradient elution mode，and external standard method peak area quantification.The results show that the linear range of nine kinds of sulfanilamide was in the range of 0.05 μg/mL-10.00 μg/mL with a correlation coefficient of 0.999 0-0.999 8.The detection limit was 10μg/kg-15μg/kg and the quantitative limit was 30 μg/kg-45 μg/kg.The recovery rate was 79.2%-84.7%.

high performance liquid chromatography（HPLC）；sports nutrition；sulfanilamide residue

2017-01-09

陶弥锋（1976—），男（汉），副教授，硕士，研究方向：运动训练。

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.13.035