人参多糖对耐顺铂人鼻咽癌细胞耐药的逆转作用及其机制

2017-07-01孙冰洁

山东医药 2017年20期

关键词：亲本鼻咽癌人参

孙冰洁

(第二军医大学学员旅，上海 200433)

人参多糖对耐顺铂人鼻咽癌细胞耐药的逆转作用及其机制

孙冰洁

(第二军医大学学员旅，上海 200433)

目的探讨人参多糖(GPS)对耐顺铂人鼻咽癌细胞耐药的逆转作用及机制。方法选择药物敏感鼻咽癌细胞CNE-2作为亲本细胞，并建立耐顺铂的鼻咽癌耐药细胞株系CNE-2(简称耐药CNE-2)。采用MTT法检测亲本细胞及耐药CNE-2经GPS作用前后对顺铂的半数抑制浓度(IC50)，并计算耐药指数(RI)；流式细胞仪检测GPS对耐药CNE-2的增殖抑制率；RT-PCR法检测GPS作用前后耐药CNE-2中β-catenin mRNA表达；显微镜观察GPS作用前后耐药CNE-2中β-catenin蛋白表达。结果亲本细胞及耐药CNE-2对顺铂的IC50分别为(0.15±0.11)、(7.50±2.80) μmol/L，耐药CNE-2对顺铂的RI为26.8；0.1、0.2、0.3、0.4 g/L GPS作用48 h，耐药CNE-2对顺铂的IC50分别为(3.21±1.12)、(1.14±0.53)、(0.64±0.38)、(0.21±0.17)μmol/L，RI分别为9.5、6.4、3.2、1.2，GPS作用后耐药CNE-2对顺铂IC50、RI均较作用前明显降低(P均<0.05)。GPS对耐药CNE-2的增殖具有明显抑制作用，且呈剂量和时间依赖性(P均<0.05)。0.1、0.2、0.3、0.4 g/L GPS处理48 h，耐药CNE-2中β-catenin mRNA相对表达量分别为0.973±0.114、0.809±0.038、0.706±0.050、0.297±0.010，与耐药CNE-2比较，0.3 g/L及0.4 g/L GPS作用后β-catenin mRNA相对表达量均明显降低(P均<0.05)。GPS作用前β-catenin蛋白的表达区域在细胞核以及细胞质，经GPS处理后，β-catenin蛋白表达区域逐渐向细胞膜转移。结论 GPS可逆转CNE-2对顺铂的耐药性；其机制可能为通过β-catenin信号转导途径诱导耐药株系凋亡。

鼻咽癌；人参多糖；耐顺铂；多药耐药；耐药逆转

鼻咽癌对放射治疗和化学治疗较为敏感，但近年来出现了耐药细胞株，患者5年存活率仅60%左右[1]。研究发现，人参的主要药用价值成分人参多糖(GPS)在人体内外均具有较为明显的抗肿瘤及逆转肿瘤耐药作用[2]，但其机制仍不清楚。2016年2～10月，本研究观察了GPS对耐顺铂人鼻咽癌细胞耐药的逆转作用，现分析结果并探讨其机制，以期解决鼻咽癌的多药耐药问题。

1 材料与方法

1.1 材料 GPS注射液为普德药业公司(山西)生产(规格3 g/L)，顺铂为澳大利亚某公司生产；人鼻咽癌低分化细胞株系CNE-2为香港大学肿瘤系所提供，二甲基四氮唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)为Sigma公司生产，CCK8试剂由日本同仁研究所提供。

1.2 实验方法

1.2.1 耐药细胞株诱导将CNE-2细胞置于37 ℃、5% CO2及适宜湿度的培养箱中培养[3]。采用MTT法测定顺铂对CNE-2细胞的半数抑制浓度(IC50，0.21 μmol/L)；用含顺铂3.3 μmol/L的培养基培养细胞1天，换含有半数抑制浓度的培养基来培养8天，直至细胞能够稳定生长，继续传代3次[4]，测定此时的IC50。再用含顺铂3.3 μmol/L的培养基冲击培养1天，更换为顺铂IC50逐渐提高的培养基，直至细胞能够在含顺铂3.3 μmol/L的培养基中稳定生长并且连续传代3次[5]，最后测定顺铂的IC50为7.5 μmol/L，同时将其命名为耐顺铂的鼻咽癌耐药细胞株系CNE-2(简称耐药CNE-2)。

1.2.2 GPS干预及药物敏感性测定采用MTT法。取对数生长期的亲本细胞及耐药CNE-2，调整细胞密度1×105个/mL，加入96孔板，设亲本细胞、耐药CNE-2及GPS(0.1、0.2、0.3、0.4 g/L)处理孔，每孔体积200 μL，做3个平行孔板[6]。培养48 h，于每个孔加入15 μL MTT(10 mg/mL)，继续培养4 h，吸出培养基，于每孔中加入200 μL DMSO，稍震荡溶解结晶。以490 nm作为检测波长，并在酶标仪上检测各孔的吸光度数值[7]，利用MTT分析软件来进行数据分析，计算IC50以及耐药指数(RI)，得出药物敏感性。RI=耐药细胞IC50/亲本细胞IC50。

1.2.3 GPS对耐药CNE-2增殖影响的观察采用CCK8法。取对数生长期耐药CNE-2，制成密度为5×104个/L的细胞悬液，将100 μL的细胞悬液接种在96孔板上，1天后加入100 μL不同浓度(0.1、0.2、0.3、0.4 g/L)的GPS培养液，并设空白对照，于作用24、48、72 h时进行CCK8比色试验[8]。每次均在处理结束前4 h，在每个孔中加入10 μL的CCK8溶液，继续培养4 h，于450 nm处测定吸光度(A)值，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=(1-AGPS/A空白对照)×100%[9]，结果重复3次。

1.2.4 GPS对耐药CNE-2 β-catenin mRNA表达影响的观察采用RT-PCR法。取对数生长期，并经0.1、0.2、0.3、0.4 g/L GPS处理48 h的耐药CNE-2，TRIzol法提取RNA，检测β-catenin mRNA表达。PCR反应步骤：反应体系10 μL(2.5 μL模板，上下引物均匀后取2.5 μL，5 μL的SYBR荧光酶)，循环环境条件：95 ℃预变性10 s，95 ℃ 5 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，共40个循环。最终数据利用ABI Prism 7000 SDS软件进行相关数据分析，ΔCt=源基因Ct-内参照Ct，mRNA的表达=2-ΔCt[10]。

1.2.5 GPS对耐药CNE-2 β-catenin蛋白表达区域影响的观察采用显微镜观察耐药CNE-2中β-catenin蛋白表达区域。取对数生长期耐药CNE-2，接种于6孔板中，37 ℃下于CO2培养箱过夜，待细胞株均贴壁后，加入0.4 g/L GPS处理48 h，空白对照加完全培养基继续培养。4%多聚甲醛室温条件下固定20 min，PBS冲洗3次(每次10 min)，5%的BSA封闭透膜1 h，PBS冲洗3次(每次5 min)[11]。β-catenin单克隆抗体溶液的稀释浓度为1∶400，显微镜观察结果。

2 结果

2.1 GPS作用前后耐药CNE-2对顺铂IC50及RI比较亲本细胞及耐药CNE-2对顺铂的IC50分别为(0.15±0.11)、(7.50±2.80) μmol/L，耐药CNE-2对顺铂的RI为26.8；0.1、0.2、0.3、0.4 g/L GPS作用48 h，耐药CNE-2对顺铂的IC50分别为(3.21±1.12)、(1.14±0.53)、(0.64±0.38)、(0.21±0.17)μmol/L，RI分别为9.5、6.4、3.2、1.2，GPS作用后耐药CNE-2对顺铂IC50、RI均较作用前明显降低(P均<0.05)。

2.2 GPS对耐药CNE-2增殖的影响 GPS对耐药CNE-2的增殖具有明显抑制作用，且呈剂量和时间依赖性(P均<0.05)。见表1。

表1 不同浓度和时间点GPS对耐药CNE-2的增殖抑制率

注：与0.1 g/L比较，#P<0.05；与相同浓度作用24 h比较，*P<0.05。

2.3 耐药CNE-2 β-catenin mRNA表达 0.1、0.2、0.3、0.4 g/L GPS处理48 h后耐药CNE-2中β-catenin mRNA相对表达量分别为(0.973±0.114)、(0.809±0.038)、(0.706±0.050)、(0.297±0.010)，组间比较P<0.05。

2.4 耐药CNE-2 β-catenin蛋白表达区域 GPS作用前β-catenin蛋白的表达区域在细胞核以及细胞质，经GPS处理后，β-catenin蛋白表达区域逐渐向细胞膜转移。

3 讨论

肿瘤细胞耐药性的发生是药物作用诱导的结果还是“不适者淘汰”的选择机制所致，目前尚无定论，更多学者倾向于双向作用机制，因为耐药诱导阶段，不论是大剂量冲击还是小剂量逐渐增加，在特定的时间段都会引起培养细胞的死亡，存活细胞也会在形态上有显著改变，并失去增殖活性[12]。同时在耐药起初阶段，反复出现的过程需要更多的新鲜亲代细胞源源不断的补充，补充的新鲜亲代细胞和已经具备一定耐药性但无增殖能力的细胞之间会建立一种“信息交流”途径，使得具有增殖能力且耐药性细胞最终被选择出来，诱导分化，最终耐药菌株大量出现。

GPS可明显增加人体的免疫系统功能，还有抗肿瘤以及辅助治疗肿瘤性疾病的功能，可提高因放疗而被抑制的免疫系统功能[13]，可在一定程度上减轻放疗不良反应。GPS能调节免疫功能，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞的浸润和转移，还能逆转肿瘤细胞的多药耐药性、抑制肿瘤致病因子的作用和抗基因突变。Wnt/β-catenin信号传导通路发生异常改变时与肿瘤的发生密切相关，而β-catenin是Wnt/β-catenin经典信号传导通路中非常重要的信号传递分子。谢方云等[14]研究发现，Wnt/β-catenin经典信号传导通路的异常激活以β-catenin分子改变为核心，发现鼻咽癌有Wnt/β-catenin经典信号传导通路的激活。本研究发现，GPS作用后，耐药CNE-2的IC50及RI均明显降低，耐药CNE-2增殖明显抑制，且呈剂量和时间依赖性；耐药CNE-2β-catenin mRNA相对表达明显降低，β-catenin蛋白的表达区域向胞膜转移，可见GPS下调了β-catenin的转录功能以及蛋白的翻译表达过程，可能原因在于TCF4作为一种研究较为透彻的Wnt/β-catenin信号传导通路常见的下游信号分子，当Wnt分子信号被激活后，TCF4所对应的氨基端会与Wnt信号传导通路的上游信号传导分子β-catenin Arn重复序列结合形成复合体，并将其由胞质转入胞核，但氨基端的HMG分子会与启动子中的靶基因调控序列相结合，继而可发挥转录的激活作用，本研究中发现了TCF4信号分子的表达转移，所以推测GPS对于CNE-2的影响可能是通过TCF4影响β-catenin分子的胞核转移以及靶基因的活性结合产生。

综上所述，GPS对耐顺铂人鼻咽癌耐药细胞具有明显的逆转作用，其机制可能是通过β-catenin信号转导途径诱导耐药株系CNE-2的凋亡。本研究结果对指导鼻咽癌的进一步治疗以及改善患者预后具有一定意义。

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