强精片对雷公藤所致不育症大鼠精液质量的影响及机制

曲晓伟，陈帝昂，李广森，常德贵，张培海

(1郑州人民医院，郑州 450003；2 成都中医药大学临床医学院；3 成都中医药大学附属医院；4成都中医药大学第二附属医院)

·基础研究·

强精片对雷公藤所致不育症大鼠精液质量的影响及机制

曲晓伟1，陈帝昂2，李广森3，常德贵4，张培海3

(1郑州人民医院，郑州 450003；2 成都中医药大学临床医学院；3 成都中医药大学附属医院；4成都中医药大学第二附属医院)

目的 探讨益肾活血利湿中药强精片对雷公藤所致不育症大鼠精液质量的影响及其机制。方法 实验动物为50只雄性SD大鼠，10只作为空白组，另40只以雷公藤灌胃制作不育症模型并随机等分为模型组及强精片低、中、高剂量组，四组均予雷公藤20 mg/(kg·d)灌胃；强精片低、中、高剂量组同时分别予强精片58、105、233 mg/(kg·d)灌胃；空白组予等量生理盐水灌胃；均1次/d。灌胃后4周检测各组精液质量、血清性激素水平及睾丸组织Cx43蛋白表达。结果 各强精片组精液质量均好于模型组，血清睾酮水平及睾丸组织Cx43蛋白表达均高于模型组，且呈现出一定的量效关系(P<0.05或<0.01)。结论 益肾活血利湿中药强精片可改善不育症大鼠的精液质量，其作用机制可能为调节血清睾酮水平及睾丸组织Cx43蛋白表达。

不育症；精液质量；强精片；中药；性激素；细胞间隙连接蛋白；大鼠

近年来不孕不育的发病率呈不断上升趋势。欧洲泌尿学协会(EAU)指出，截止2013年，约15%夫妇在结婚1年内不能怀孕，需干预性治疗，其中约50%的夫妇被发现男方精液参数存在异常[1]。目前，西医治疗不育症的临床效果尚不令人满意，而传统医学在此方面具有一定的优势[2,3]。强精片是在成都中医药大学附属医院院内制剂增精1号、增精颗粒基础上优选而成，主要作用为益肾活血利湿。2013年1月～2014年1月，本研究观察了强精片对不育症模型大鼠精液质量的影响，现分析结果并探讨其机制，旨在为该药用于不育症的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物：清洁级雄性SD大鼠50只，由成都中医药大学动物实验中心提供(川实动管质第114号)，2.5～3个月龄，体质量210～230 g。实验期间饲养室温度20～30 ℃，12 h光、12 h暗，自由摄食全价大颗粒饲料及饮水，驯养l周后备实验用。实验药物及试剂：强精片由成都中医药大学附属医院提供(批号：000613)，规格为0.35 g/片，100片/瓶。将强精片研末，并溶于1%的羧甲基纤维素钠溶液(CMC-Na)中，配制成实验所需浓度混悬液备用。雷公藤多甙片(以下称雷公藤)由上海医科大学红旗制药厂生产(批号：990219)，规格为10 mg/片。将雷公藤研末，溶于1%的CMC-Na中，配制成浓度为2 mg/mL混悬液备用。睾酮(T)、促卵泡成熟激素(FSH)、黄体生成激素(LH)放射免疫分析试剂盒(天津德普生物技术和医学产品有限公司)，考马斯亮蓝染液(PA101，北京天根生化公司)，BA200 Digital数码三目摄像显微摄像系统(麦克奥迪实业集团有限公司)，DYY-7C型转印电泳仪器、DYCZ-24DN型电泳仪(北京六一仪器厂)，显影定影液(日本柯达公司)，Gel-Pro Analyzer免疫印迹分析软件(中国上海Informax Inc.)，Image-Pro Plus6.0图像分析系统(美国Media Cybernetics公司)，WLJY-9000型精子质量检测系统(CASA)。1.2 不育症模型制作及干预 取10只大鼠为空白组；取40只大鼠为造模组，制作不育症模型[4～6]：以雷公藤混悬液(浓度2 mg/mL)灌胃，1次/d，连续3周。3周后两组各随机抽取10只行模型评价。造模组附睾精子密度、活力及活率均降低，与空白组比较有极显著差异，说明模型大鼠睾丸及附睾功能障碍，生殖力降低，提示造模成功。验证模型成功后，将40只模型大鼠随机分为模型组及强精片低、中、高剂量组，各10只。四组均继续予雷公藤20 mg/(kg·d)灌胃，同时强精片低、中、高剂量组分别予强精片58、105、233 mg/(kg·d)灌胃；另设空白组(10只)，予等量生理盐水灌胃。灌胃均1次/d，共4周。实验过程中各组大鼠均自由摄食、饮水。实验过程中模型组2只、强精片高剂量组1只死亡。

1.3 相关指标观察 各组于末次灌胃2 h行腹主动脉取血10 mL，室温静置30 min后，2 500 r/min离心25 min，取血清。摘取大鼠双侧睾丸，去除白膜及大血管，液氮冻存，并留取电镜标本。

1.3.1 精液质量检测 摘取大鼠双侧睾丸即刻，参考俞莉春等[7]、商学军等[8]收集检测精液方法稍加改进，应用扩散法收集附睾尾部精子。取附睾尾部放入37 ℃生理盐水(提前预热)3 mL中，剪碎组织，放置1～2 min，取精子混悬液，加入1 mL M199中，37 ℃恒温水浴5 min，取适量加到预温的血细胞计数板上，应用WLJY-9000型精子质量检测系统行精子质量分析。将经处理的精子混悬液涂于计数载玻片上，取4个视野，于2 min内完成检测。检测指标：精子密度(1×106个/mL)、精子活力(%)、精子活率(%)。1.3.2 睾丸组织病理学观察 睾丸组织行HE染色，光学显微镜下观察组织病理学变化。

1.3.3 睾丸组织Cx43蛋白表达检测 取各组液氮冷冻睾丸组织约100 mg，放入1 mL预冷的RIPA组织裂解液中，在玻璃匀浆器中匀浆破碎细胞，操作在冰上进行，每次匀浆约1 min，间隔5 min匀浆1次，共5次。4 ℃下放置2 h。4 ℃下12 000 r/min离心约5 min，取上清液。分装少量上清液用于总蛋白浓度的测定，其余的加入等体积2×加样缓冲液，100 ℃水浴10 min，分装后-20 ℃保存。依照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书进行操作：配置浓度为0.5 mg/mL的蛋白标准液，用于标准曲线的绘制。参考使用说明，完成样品的上样、转膜、NC膜的封闭与抗体孵化、显影。在X线片机下对曝光后的X片照相，应用Gel-Pro Analyzer4.0图像分析软件对蛋白条带的灰度值参数进行测量计算。采用Gel-Pro Analyzer免疫印迹分析软件对图像多次检测条带OD值，取平均值。

1.3.4 血清性激素水平测定 采用放射免疫法测定各组血清T、FSH、LH。按试剂盒说明操作。

1.4 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。多组比较采用单因素方差分析，方差齐性用LSD、S-N-K检验，方差不齐采用秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组精液质量比较 见表1。

表1 各组精液质量检测结果比较

注：与空白组比较，△P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，▲P<0.01；与强精片低、中剂量组比较，●P<0.05。

2.2 各组睾丸组织病理学变化 空白组睾丸生精小管圆而饱满，生精上皮完整，管壁生精细胞、支持细胞分层排列有序， 支持细胞间紧密连接，精原细胞致密规律排列，管腔内见大量成熟精子，生精小管间见疏松间质组织，间质无充血水肿，无炎细胞浸润及纤维结缔组织增生。模型组睾丸生精小管管径大小不一，管壁细胞减少，排列紊乱，生精上皮变薄，部分基底膜破裂溶解，初级、次级精母细胞和精细胞锐减，细胞间隙增大，支持细胞间连接变宽，部分管腔阻塞或塌陷，成熟精子消失，间质水肿、轮廓不清。强精片各组生精小管基膜基本完整，管壁厚而圆，可见各个发育阶段的生精细胞和支持细胞，管腔中有较多成熟的精子，间质细胞成群分布于生精小管之间的疏松结缔组织内，且呈现出一定的量效关系。2.3 睾丸组织Cx43蛋白表达 空白组、模型组及强精片低、中、高剂量组睾丸组织Cx43蛋白相对表达量分别为0.562 7±0.029 0、0.449 9±0.035 0、0.475 1±0.048 5、0.504 0±0.023 0、0.507 6±0.047 0，模型组与空白组比较P<0.05，强精片中、高剂量组与模型组比较，P均<0.05。见图1。

注：BG为空白组；MG为模型组；QJPL/QJPM/QJPH分别为强精片低、中、高剂量组。

2.4 各组血清性激素水平 见表2。

表2 各组血清T、FSH、LH水平比较

注：与空白组比较，△P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，▲P<0.01；与强精片低、中剂量组比较，●P<0.01。

3 讨论

强精片为临床经验方药增精1号、增精颗粒优选而成，主要成分为人参、鹿角、当归、枸杞子、菟丝子、淫羊藿等，具有益肾活血利湿之功。前期相关研究表明，该经验方可增加附睾重量和管壁厚度，促进损伤附睾上皮恢复和上皮细胞的分泌，从而改善附睾精子成熟功能，提高精子质量[9～11]；强精片的具体作用效果及机制尚不明了。且当前传统医学在此领域的理论基础尚不完善和系统，其改善精子质量的作用机制尚不明晰，特别是对睾丸精子发生微环境等方面的研究尚不够深入。

本研究结果显示，与空白组比较，模型组精子密度、活力、活率明显降低；强精片各组在用药4周后精子密度、活力、活率均有提高，且呈现出一定的量效关系，其中以高剂量组对精液质量改善效果最为显著，低剂量组与中剂量组比较差异无统计学意义。提示强精片能够改善精液质量。本研究睾丸组织病理学结果显示，强精片各组睾丸组织病理改变程度明显轻于模型组，且呈现出一定的量效关系。提示强精片可促进损伤附睾上皮恢复和上皮细胞分泌。

丘脑-垂体-性腺轴调控系统作为人体内重要的激素调控网络，是睾丸生理功能正常发挥的前提条件。下丘脑分泌的促性腺激素释放激素刺激垂体分泌LH和FSH。睾丸间质细胞在LH脉冲式释放的生理刺激下连续不断的生成和分泌T。T经血液循环进入精曲小管，供精子生成所需。FSH随着血液循环到睾丸，与精曲小管的支持细胞膜受体结合，刺激性激素结合蛋白(TBG)的生成，高浓度TBG使精曲小管腔内的T浓度维持在较高的水平，可促进生殖细胞分化为成熟的精子[12]。研究发现，大鼠睾丸中睾酮的消除可导致生殖细胞凋亡的增加，证实睾酮可能具有细胞存活因子的功能，可阻止生殖细胞凋亡，亦表明男性体内的睾酮是一种关键的生殖细胞存活因子[13]。本研究结果显示，雷公藤对血清性激素水平影响不大，但空白组相比模型组血清睾酮值明显降低，与国内学者的研究结果基本一致，这可能与雷公藤的灌胃浓度、灌胃次数及时间等因素有关[14]。研究发现，雷公藤在一定浓度下能够抑制Sertoli细胞、Leydig细胞的细胞活性，这可能是雷公藤导致睾酮下降的原因之一[15]。本研究强精片各组血清睾酮明显高于模型组，但各组血清FSH、LH水平无明显统计学差异，说明强精片可调节大鼠血清睾酮水平；其机制可能是通过拟性激素样作用直接调控丘脑及垂体、抗氧化应激、抑制生殖细胞衰老基因表达、激活性腺轴系统相关酶活性及促进激素分泌等方式，最终改善和调整性腺轴系统的器官形态结构，从而改善睾丸生精功能，提高生殖能力。

睾丸组织内主要包括生精细胞、间质细胞及支持细胞三种功能细胞。其中生精细胞为产生精子的“原料”，间质细胞和支持细胞则辅助生精细胞生成精子，对精子的生成和睾丸正常功能的维持具有重要作用。睾丸支持细胞构成血睾丸屏障、维持睾丸内正常微环境，对生殖细胞起着支持和营养作用；睾丸间质细胞则分泌雄激素等活性物质以调节生殖功能。研究表明，这两种细胞的作用与其细胞间的缝隙连接(GJ)功能密切相关。GJ是细胞间的一种特殊通道，沟通相邻细胞的胞质，介导细胞间直接的信号传递。GJ由特殊的连接蛋白组成，Cx43作为睾丸中表达最丰富的连接蛋白，是睾丸内细胞间通信的重要物质基础。睾丸支持细胞表达Cx43占90%以上；睾丸间质细胞则仅表达Cx43。由Cx43组成的GJ介导睾丸支持细胞对生精细胞的支持和营养作用，对睾丸间质细胞的内分泌活动也起重要调节作用[16～18]。雷公藤能够从RNA水平干扰Cx43蛋白的合成，降低生殖细胞Cx43蛋白表达量，影响生精细胞和其周围体细胞间的代谢交换和内分泌、旁分泌生长因子的传递，从而影响睾丸生殖功能[19]。本研究模型组睾丸组织内Cx43蛋白表达量明显下降，提示雷公藤可能通过抑制Cx43表达，影响了睾丸内支持细胞、间质细胞的功能以及支持细胞对生精细胞的调节。这与其他雷公藤生殖毒性机制的相关研究结果相符。本研究强精片中、高剂量组Cx43蛋白表达量明显高于模型组，提示强精片能提高Cx43蛋白在睾丸组织内的表达，但其对Cx43蛋白调节的具体分子机制，尚需后续研究进一步明确。

综上所述，强精片可明显改善不育症大鼠的精液质量，提高其生殖功能。推测其机制可能与调节血清睾酮水平及促进睾丸组织Cx43蛋白表达有关，尚有待进一步深入研究。

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国家自然科学基金资助项目(81302983)。

张培海(E-mail： zhangpeihai@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.20.008

R698.2

A

1002-266X(2017)20-0028-04

2016-03-24)