P16和SOX2蛋白在子宫颈活检上皮内瘤变中的诊断意义

桂华伟,王绪明,黄利华,黄 萱,陈琼霞,刘丽江*

(1.武汉市普爱医院 病理科，湖北 武汉430056;2.江汉大学江大病理诊断所组织病理部)

P16和SOX2蛋白在子宫颈活检上皮内瘤变中的诊断意义

桂华伟1,王绪明2,黄利华1,黄 萱2,陈琼霞2,刘丽江2*

(1.武汉市普爱医院 病理科，湖北 武汉430056;2.江汉大学江大病理诊断所组织病理部)

目的 研究P16、P53、SOX2及Ki-67在子宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)病变中的表达及临床价值分析。方法 收集子宫颈活检病例92例，用免疫组化染色检查P16、P53、SOX2及Ki-67在子宫颈CIN病变表达中的表达情况，分析其与CIN分级的相关性。结果 P16蛋白的表达与分布与CIN形态学分级之间有较好的一致性。SOX2阳性细胞在鳞状上皮中的分布与CIN的分级趋向一致。P53蛋白和Ki-67指数与CIN的分级趋向一致。结论 在临床实践中，对于子宫颈小样本活检的CIN的分级，将HE染色的形态学观察与P16、P53、SOX2及Ki-67的免疫组化检查相结合，可获得比较客观的明确诊断，且重复性较好。

子宫颈活检；上皮内瘤变；P16；P53；SOX2；Ki67

(ChinJLabDiagn,2017,21:0942)

子宫颈癌是我国常见的恶性肿瘤之一，尽管早期发现早期治疗已经取得了明显的成效，但其死亡率仍居我国女性恶性肿瘤死亡率的前10位[1]。子宫颈活检是目前确定子宫颈癌最为可靠的方法，即所谓“金标准”。但是，在临床病理诊断的实践中，对于小样本活检确定子宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)，或称低级别/高级别上皮内瘤变、原位癌以及浸润癌时，还是面临着一定的困境，尤其是CIN分级的确定。不同医院的病理科医生，甚至同一医院的病理科医生由于经验的不同，仅通过HE染色切片对同一病例的CIN分级判断会有较大的差别。例如，有的病例，一部分医生会诊结果是考虑宫颈腺体发生鳞状上皮化生，另外一部分医生则诊断考虑为CIN Ⅲ级，这就给临床医生选择治疗方案带来困惑。明确的诊断是治疗的前提，不同的CIN分级，所选择的治疗方案也有所不同。在受检材料有限的情况下，如何借助现有的先进手段，尽可能为临床治疗提供准确的CIN分级，是本文试图解决的科学问题。

免疫组化染色技术在临床病理诊断中已经应用的非常广泛了而且也已成为诊断所依靠的重要条件之一。P16蛋白、P53蛋白等在子宫颈CIN中的表达及临床价值已有大量的文献报告[2]，但还缺乏比较一致的意见，并且重复性较为欠缺，即同一个病例不同的病理医师可能给出不同的意见。本研究拟从HE染色的形态学变化结合P16、P53和SOX2蛋白的表达以及Ki-67指数的结果，综合确定CIN的分级，以探索更为客观可行的诊断依据。

1 材料与方法

1.1 临床资料 收集武汉市普爱医院和江大病理诊断所2013年1月-2015年6月子宫颈活检病例92例，年龄为32-69岁，平均年龄为48.5岁。其中CIN 1级19例，CIN 2级11例，CIN 3级(子宫颈鳞状细胞原位癌)62例，全部病例有完整的临床信息和随访资料，并且未做过任何放化疗等。全部病例均经两位病理医师复核诊断且符合研究要求。所有样本均为常规10%中性福尔马林固定，石蜡包埋的组织。

1.2 免疫组化染色检查 操作程序按照免疫组化染色质量控制要求执行。P16抗体为北京中杉金桥生物技术有限公司产品(克隆号：3G5D5)，P53抗体为武汉博士德生物工程有限公司产品(克隆号：4A8)，SOX2抗体为北京中杉金桥生物技术有限公司产品(克隆号：EP103)，Ki-67抗体为北京中杉金桥生物技术有限公司(克隆号：UMAB107)。SupePictureTM 3rd Gen IHC Detection Kit为北京中杉金桥生物技术有限公司产品(产品编号：87-8973)。浓缩型DAB试剂盒为北京中杉金桥生物技术有限公司产品(产品编号：ZLI-9017)。

1.3 P16以细胞浆呈现棕黄色为阳性，P53、SOX2及Ki-67以细胞核呈现棕黄色为阳性。根据阳性细胞的数量进行分级：每张切片上观察5个高倍视野(*200)，计数阳性细胞百分比，阳性细胞数<5% 为0分，5%-25% 为1分，26%-50% 为2分，51%-75% 为3分，76%-100% 为4分。②阳性着色强度：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。③ 两者计分相乘即为阳性等级：0分为阴性(-)，1-4分为弱阳性(+)，5-12分为阳性(++)。Ki-67以阳性细胞占统计细胞总数的百分比表示。

1.4 统计分析 数据经统计软件SPSS17.0 处理，蛋白表达与形态学变化的相互关系分析用卡方检验，以P值≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床病理特征 全部病例均为子宫颈小样本活检组织，出现典型的鳞状上皮化生伴有不典型增生，CIN 1级为不典型增生病变累及鳞状上皮全层下1/3，CIN2级为病变累及鳞状上皮全层下2/3，CIN3级为病变累及鳞状上皮2/3以上至全层，未突破基底膜。不典型增生的细胞核大深染，可见核分裂，CIN3级细胞异型性明显，排列紊乱。

2.2 P16、SOX2、P53蛋白表达及Ki-67增殖指数与CIN分级 全组病例中，19例CIN1级中仅有1例P16蛋白阳性，且阳性细胞位于鳞状上皮的底层，阳性信号也比较弱。62例CIN3级的病例中，51例均为强阳性表达，并且阳性信号均为鳞状上皮全层(图1)，提示P16蛋白的表达与分布与CIN形态学分级之间有较好的一致性。SOX2蛋白定位于细胞核，本组病例中，62例CIN3级的病例中，49例SOX2为强阳性表达，并且阳性信号均为鳞状上皮全层(图1)，11例CIN2级的病例中，8例为阳性表达，SOX2阳性细胞在鳞状上皮中的分布与CIN的分级趋向一致，尤其是CIN2级和CIN3级。P53蛋白定位于细胞核(图1)，在CIN1级和CIN2级中阳性细胞比例低于CIN3级，差异有统计学意义。本组资料中Ki-67指数以20%为界分组(图1)，与CIN形态学分级间有明确关系(表1)。

表1 子宫颈组织中P16，SOX2及P53蛋白的表达与CIN分级

3 讨论

3.1 P16蛋白与HPV的感染 HPV在子宫颈癌的发生中发挥重要作用，其中HPV16/18型被认为是最常见的高危险亚型[2]。在子宫颈鳞状细胞癌中，HPV16/18型被检出的频率很高，虽然缺乏HPV感染导致宫颈癌发生的直接证据，但其作为一种非常常见的伴随现象已有大量的证据。P16蛋白作为HPV转染子宫颈细胞的重要分子标志物，在细胞内的积聚，使得我们可以用免疫组化染色的方法，清晰地观察到[3]。因此，在子宫颈细胞癌变的过程中，我们可以通过P16蛋白的表达，获得HPV转染细胞的证据。

3.2 慢性子宫颈炎伴有CIN时，对于分级的判断，仅依据形态学的观察，常常有一定的困难，尤其是小样本活检，鉴于组织小而且局限，重复性不够好。HPV16/18型原位杂交的结果可证实有无HPV转染，但对于CIN分级的评价尚不明确。因为，杂交信号与CIN的形态学分级之间似乎缺乏一致性，尤其是表层细胞的阳性率比较低。从我们的研究结果来看，P16蛋白阳性表达的分布方式与CIN1-3级形态学变化之间有良好的相关性。即CIN1级，P16蛋白在鳞状上皮的下1/3层细胞表达或不表达，在CIN2级则在鳞状上皮2/3层以内的细胞表达，CIN3级则为2/3以上至全层弥漫阳性，与文献报道相一致[4]。因此，在临床病理诊断实践中，利用P16蛋白作为诊断CIN分级的客观指标之一，有着重要的临床意义。

图1A 子宫颈鳞状细胞癌，SOX2呈胞核弥漫阳性。图1B SOX2蛋白在CIN1级(低级别上皮内瘤变)中的表达，呈胞核阳性。 图1C P53蛋白在CIN1级(低级别上皮内瘤变)中的表达，呈胞核阳性。图1D SOX2蛋白在CIN2级中的表达，呈胞核阳性。 图1E ki-67蛋白在CIN2级中的表达，呈胞核阳性。图1F P16蛋白在CIN2级中的表达，呈胞浆阳性。图1G SOX2蛋白在 CIN3级(高级别上皮内瘤变)中的表达，呈胞核阳性。图1H P16蛋白在CIN3级(高级别上皮内瘤变)中的表达，呈胞浆阳性。 图1I P53蛋白在CIN3级(高级别上皮内瘤变)中的表达，呈胞核阳性。

图1 P16，P53，SOX2和Ki67在宫颈上皮组织CIN病变中的表达

3.3 SOX2蛋白与CIN分级 SOX2是非常重要的转录因子，在调节细胞周期、DNA的损伤修复以及多种肿瘤干细胞的自我更新方面发挥重要作用[5]。近期文献报告，SOX2蛋白的表达与子宫颈癌的形成、宫颈癌细胞株的侵袭转移及肿瘤干细胞的自我更新相关[6]。本组的结果显示，SOX2蛋白在CIN2-3级(即高级别上皮内瘤变)中呈现高表达，并且与形态学变化有比较好的一致性。但在浸润性鳞癌中的表达下降(数据未显示)，与文献不一致[7]，可能与入选的病例数量有限相关，需要进一步证实。

3.4 形态学观察与免疫组化检查结果的综合评价 本项研究结果显示，在子宫颈小样本活检的临床实践中，对于CIN的分级，若将HE染色的形态学观察与P53，Ki67，P16和SOX2的免疫组化检查相结合，可获得比较客观的明确诊断，并且具有重复性好的特点。

[1]2013中国卫生统计年鉴http://www.nhfpc.gov.cn/htmlfiles/zwgkzt/ptjnj/year2013/index2013.html

[2]Zhang G,Yang B,Abdul-Karim FW.p16 Immunohistochemistry is useful in confirming high-grade squamous intraepithelial lesions (HSIL) in women with negative HPV testing[J].Int J Gynecol Pathol,2015,34(2):180.

[3]Wentzensen N,von Knebel,Doeberitz M.Biomarkers in cervical cancer screening[J].Dis Markers,2007,23(4):315.

[4]Capobianco G,Marras V,Wenger JM,et al.P16 immunostaining and HPV testing in histological specimens from the uterine cervix[J].Eur J Gynaecol Oncol,2013,34(3):227.

[5]Peng C,Li N,Ng YK,et al.A unilateral negative Feedback loop between miR-200 microRNAs and Sox2/E2F3 controls neural progenitor cell-cycle exitand differentiation[J].J Neurosci,2012,32(38):13292.

[6]Ji J,Zheng PS.Expression of Sox2 in human cervical carcinogenesis [J].Hum Pathol,2010,41(10):1438.

[7]Chang X,Zhang J,Huang C,et al.Sex-determining region Y-related high mobility group box (SOX)-2 is overexpressed in cervical squamous cell carcinoma and contributes cervical cancer cell migration and invasion in vitro[J].Tumour Biol,2015,36(10):7725.

Significance of P16 and SOX2 protein in the diagnosis of cervical intraepithelial neoplastic

GUIHua-wei1,WANGXu-ming2,HUANGLi-hua1,etal.

(1.DepartmentofPathology,WuhanPuaiHospital;2.Departmentofhistopathology,JiangdaPathologyInstitute,Wuhan430056,China)

Objective To study the relationship between the expression of P16,P53,SOX2 and Ki67 and cervical CIN lesion.Methods To examine the expression of P16,P53,SOX2 and Ki-67 in 92 cases of cervical CIN lesions by immunohistochemistry,and analyze the correlation between the expression of and CIN classification.Results There was a good agreement between the expression and distribution of P16 protein and the morphological classification of CIN.The distribution of SOX2 positive cells in the squamous epithelium was consistent with the CIN classification.The clear relationship between P53 protein and Ki-67 index and CIN morphological classification has also been shown.Conclusion The combination of immunohistochemical examination of hematoxylin and eosin staining of morphological observation and P16 and P53 and SOX2 and Ki-67 get clear diagnosis more objective and repeatable in clinical practice for the classification of cervical small biopsy samples of CIN.

Cervical biopsy；Intraepithelial neoplastic；P16；P53；SOX2；Ki67

国家自然科学基金资助项目(No.81272754)

*通讯作者

1007-4287(2017)06-0942-04

R737.33

A

桂华伟，男，40岁，病理医师，研究方向：肿瘤发病机制。参考文献：

2016-12-18)