高血压伴肥胖患者血浆CD31+/CD42b+血小板来源微泡研究

李乾豪，仉红刚，张秋菊，修瑞娟

(北京协和医学院 中国医学科学院微循环研究所 卫生部微循环重点实验室，北京100730)

高血压伴肥胖患者血浆CD31+/CD42b+血小板来源微泡研究

李乾豪，仉红刚*，张秋菊，修瑞娟

(北京协和医学院 中国医学科学院微循环研究所 卫生部微循环重点实验室，北京100730)

目的 对高血压伴肥胖患者血浆中CD31+/ CD42b+表型的血小板来源微泡进行研究和分析。方法 本研究共计招募29例高血压患者，其中19例为高血压不伴肥胖；10例为高血压伴肥胖；采用分步离心法分离制备血小板微泡，以小鼠抗人CD42b-FITC，小鼠抗人CD31-PE，小鼠IgG1-PE/k同型对照和小鼠IgG1-FITC/k同型对照进行血小板微泡流式细胞术分析，采用SPSS17.0统计学软件，计量数据是正态分布的采用均数±标准差，两组间数据比较采用独立样本t检验法；不是正太分布的数据采用百分位法表示，并通过LG转换为正态分布，两组间数据比较采用独立样本t检验及非参数分析中的Mann-Whitney U检验法。计数资料采用卡方检验。血小板微粒和临床各参数之间的相关性采用多元线性回归分析。结果 高血压不伴肥胖组的患者年龄及高密度脂蛋白(HDL)明显高于高血压伴肥胖组，而甘油三酯与高密度脂蛋白比值(TG/HDL)显著低于高血压伴肥胖组；CD31+/42b+血小板微粒(PMPs)在高血压伴肥胖症患者的外周血中的数量(154.9±216.2)明显高于高血压不伴肥胖患者(14.7±17.24，P=0.003)；血小板微粒的数量与患者年龄、性别和其他临床参数包括BMI、收缩压/舒张压、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)、甘油三酯(TG)和血小板(PLT)水平无显著相关性，与高密度脂蛋白(HDL)和血脂指数包括TC/HDL-C、LDL-C/HDL-C、log(TG/HDL-C)显著相关。结论 血小板微泡水平与HDL-C水平及血脂指数呈显著的相关性，血小板微泡是一个潜在的高血压伴肥胖的标记物，同时也是可以用来预测冠心病(CAD)风险的生物标记物，为临床诊断和治疗肥胖症及高血压提供新的思路。

高血压；肥胖；血小板激活；血小板来源的微泡；冠心病

(ChinJLabDiagn,2017,21:0935)

有很大比例的高血压患者伴有肥胖[1]，肥胖与高血压的发生和发展密切相关[2]。新近的研究发现，在高血压患者和肥胖患者中均有血小板来源的微泡(platelet microparticles ，PMPs)的增高[3,4]，PMP有可能是联系肥胖和高血压及发生冠心病(CAD)的重要机制分子，但至今在高血压伴肥胖患者中PMP的水平情况尚未见报道。为此，本文对高血压伴肥胖患者血浆中CD31+/ CD42b-表型的PMP进行了研究，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 对象与分组

本研究共计招募29例高血压患者，其中19例为高血压不伴肥胖；10例为高血压伴肥胖。本研究高血压诊断标准为收缩压/舒张压≥140/90 mmHg，并且排除继发性高血压及以下病史的患者：慢性炎症史；慢性肾功能衰竭需要透析；肝脏或血液学疾病；自身免疫性疾病或肿瘤疾病；外周血管性疾病或呼吸系统性疾病等。肥胖诊断标准为：基于身体质量指数(body mass index,BMI)，根据中国卫生部提出的BMI(kg/m2)分类标准：正常：18.5-23.9；超重：24-27.9；肥胖：≥28。上述病例研究均经中国医学科学院微循环研究所伦理委员会批准，并获患者知情同意。

1.2 实验仪器

微量移液器(Gilson,France)，-80℃超低温冰箱(Thermo Fisher)，台式离心机(Thermo Fisher Scientific)，振荡器(广州仪科实验室技术有限公司)，流式细胞仪(Accuri C6,BD)。

1.3 实验试剂

0.8 μm微珠标准品(Sigma,St.Louis,MO)，小鼠抗人CD42b-FITC(BD)，小鼠抗人CD31-PE(BD)，小鼠IgG1-PE/k同型对照(BD)，小鼠IgG1-FITC/k同型对照(BD)。

1.4 实验方法和步骤

1.4.1 每个患者取外周血样本3 ml，注入被枸缘酸钠处理过的一次性抗凝管中。

1.4.2 获取样本后1 h内离心提取血小板贫瘠血浆，离心条件：a.在16℃条件下,1 500 g离心10 min，去除血细胞，获得富含血小板的血浆，移入1.5 ml的EP管中；b.在4℃条件下,13,000 g离心10 min，去除血小板，获得血小板贫瘠血浆，移入另一1.5 ml的EP管中，将EP管装入带有编号的冷冻盒中，-80℃保存待测。

1.4.3 从-80℃中取出本研究所有的样本，一次性冻融后，从每个样品中各取50 μl血小板贫瘠血浆，分别加入4 μl小鼠抗人CD42b-FITC(BD)和小鼠抗人CD31-PE(BD)；再从每个样本另各取50 μl血浆，分别加入4 μl小鼠IgG1-PE/k同型对照(BD)和小鼠IgG1-FITC/k同型对照(BD)做为同型对照。室温下避光孵育20 min。最后各管中再加入1 ml经0.22 μm孔径滤膜过滤的PBS稀释。一次冻融不影响微粒的检测。

1.4.4 取直径为0.8 μm标准大小聚苯乙烯微珠1 μl，溶于1 ml的ddH2O中，在振荡器上振荡混匀，作为内参来确定微粒的大小。

1.4.5 AccuriC6流式细胞仪上机检测：通过0.8 μm微珠在散点图中集中分布区域左下侧圈门来确定微粒的大小，结合血小板微粒相应的表面抗原来对样品管中落在该门内的微粒计数以定量PMPs；以同型对照管中微粒在单参数或双参数图中的分布划定线性门，并根据同型抗体来确定PMPs的百分率，在双参数时并进行相应的荧光补偿的调节。PMPs被定义为CD31+/42b+。

1.5 统计学处理

统计分析采用SPSS17.0统计学软件，计量数据是正态分布的采用均数±标准差，两组间数据比较采用独立样本t检验法；不是正太分布的数据采用百分位法表示，并通过LG转换为正态分布，两组间数据比较采用独立样本t检验及非参数分析中的Mann-Whitney U检验法。计数资料采用卡方检验。血小板微粒和临床各参数之间的相关性采用多元线性回归分析。P<0.05认为具有统计学差异。

2 结果

2.1 高血压组及高血压伴肥胖组临床参数比较

如表1所示，高血压不伴肥胖组的患者年龄及高密度脂蛋白(HDL)明显高于高血压伴肥胖组，而TG/HDL显著低于高血压伴肥胖组；其他临床参数无显著差异。高血压伴肥胖和高血压不伴肥胖患者血浆中PMP的流式分析见图1所示。

表1 患者临床数据

图1 高血压伴肥胖和高血压不伴肥胖患者血浆中PMP的流式分析

2.2 高血压患者伴与不伴肥胖症患者外周血中血小板微粒水平比较

统计分析结果显示，CD31+/42b+PMPs在高血压并有肥胖症患者的外周血中的数量明显高于单纯高血压患者(P=0.003)，结果见表1。

2.3 血小板微粒和临床参数的相关性分析

用多元线性回归模型来分析患者的年龄及性别与CD31+/42b+PMPs之间的相关性。分析结果显示，血小板微粒的数量与患者年龄、性别和其他临床参数包括BMI、收缩压/舒张压、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)、甘油三酯(TG)和血小板(PLT)水平无显著相关性，与高密度脂蛋白(HDL)和血脂指数包括TC/HDL-C、LDL-C/HDL-C、log(TG/HDL-C)显著相关，如表2所示。

表2 血小板微粒与各临床参数之间的相关性

3 讨论

PMPs是在血小板激活过程中产生的一种微泡状结构，在外周血细胞微粒总量中所占比例可达70%-90%[5]，是外周血中存在的主要的细胞微粒。肥胖症与血小板激活相关，在肥胖症患者中瘦素、vWF(von Willebrand factor)以及尿酸等与血小板活化相关[6]。本研究首次探索了外周血血小板微粒与高血压伴肥胖症之间的关系。研究中我们发现在高血压伴肥胖患者外周血中血小板微粒水平明显高于高血压不伴肥胖患者。

本研究补充并延伸了Csongradi等人的研究结果[7]。Csongradi等人的研究发现PMPs在有危险因素(高血压和/或2型糖尿病和/或血脂异常)人群中数量更高，但这并没有直接说明PMPs在高血压伴肥胖患者中的数量情况。本文的研究结果显示PMPs在高血压伴肥胖中显著增高。

PMPs在血栓形成和炎症过程中也发挥着重要的作用，从而进一步影响冠心病的发生发展[8]。研究[9，10]发现肥胖症与集体脂质代谢紊乱有关，尤其是HDL-C的降低及血脂指数(TC/HDL-C、LDL-C/HDL-C、TG/HDL-C)的升高，这些血脂指数，特别是TG/HDL-C，与冠心病(CAD)风险密切相关。本研究发现在高血压伴肥胖患者血浆中的HDL-C水平显著低于高血压不伴肥胖患者，而血脂指数则有升高，特别是TG/HDL-C则显著高于高血压不伴肥胖患者。同时，PMPs水平与HDL-C水平及血脂指数呈显著的相关性。因此，本研究结果能够进一步说明肥胖是CAD的危险因子之一。

另有研究[11]显示，PMPs可以降低内皮细胞一氧化氮(NO)的生物利用度，从而导致内皮细胞损伤。因此，本结果也提示肥胖可能进一步加速高血压的发生和发展，肥胖和高血压更加增加了CAD的风险。综上所述，PMPs是一个高血压伴肥胖的血浆标记物，也是可用来预测CAD风险的标记物，为临床诊断和治疗肥胖症及高血压提供新的诊治思路。

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Study of CD31+/ CD42b+PMPs in hypertension with obesity

LIQian-hao,ZHANGHong-gang,ZHANGQiu-ju,etal.

(InstituteofMicrocirculation,ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege,Beijing100730,China;KeyLabofMicrocirculation,NationalHealthandFamilyPlanningCommission,China)

Objective Aim to assess the level of plasma CD42b+PMPs in hypertension patients with obesity to find a platelet biomarker that links obesity and hypertension.Methods 29 hypertension patients,including 19 hypertension patients without obesity and 10 hypertension patients with obesity.Step by step centrifugation was used to prepare PMPs,and flow cytometry was used to analysis PMPs .Using SPSS17.0 statistical software,measuring data is to use mean + standard deviation of the normal distribution,data comparison between the two groups using independent sample t test; Not fall,according to data by percentile method and by LG is converted to a normal distribution,data comparison between the two groups using independent sample t test and the parameter analysis of the Mann - Whitney U test.Count data by chi-square test.Multiple linear regression was applied to evaluate between CD31+/CD42b+PMP and clinical variables.Results Number of CD31+/CD42b+PMPs in hypertension patients with obesity was significantly higher than hypertension patients without obesity(P=0.003).Mean HDL-C in hypertension with obesity was significantly lower than in hypertension without obesity.CD31+/CD42b+PMPs was significantly correlation with HDL-C level (P<0.05) and lipid indices including TC/HDL-C ,LDL-C/HDL-C,and Log (TG/HDL-C) (P<0.05,respectively).And CD31+/CD42b+PMPs was no significantly correlation with age,gender,BMI,SBP,DBP,TC,LDL-C,LogTG and PLT levels.Plasma HDL-C was significantly lower in hypertension with obesity than hypertension without obesity; and lipid indices were elevated in hypertension with obesity,especially TG/HDL-C was significantly higher.Conclusion Level of CD31+/CD42b+PMPs was significantly correlation with HDL-C levels and with the lipid indices including TC/HDL-C,LDL-C/HDL-c,and Log(TG/HDL-C),and it is a potential markers for hypertension with obesity,and also can be used to predict the risk of CAD.It provides a new target for clinical diagnosis and treatment of obesity and hypertension.

hypertension;obesity;platelet activation;platelet microparticles;coronary artery disease

中国医学科学院医学与健康创新项目(2016-12M-3006);中国医学科学院中央级公益性科研院所基本科研业务费项目，No.2016ZX310046;国家自然基金资助项目，No.11274046和协和青年基金项目，No.3332015033

*通讯作者

1007-4287(2017)06-0935-04

R541.3

A

李乾豪(1990-)，男，硕士研究生，研究方向：高血压病理生理。

2016-12-10)