3,3′-二吲哚甲烷对小鼠造血系统辐射损伤的保护作用

董佳丽，路璐，樊赛军

3,3′-二吲哚甲烷对小鼠造血系统辐射损伤的保护作用

董佳丽，路璐，樊赛军△

目的探讨3,3′-二吲哚甲烷（3,3′-diindolylmethane,DIM）对2 Gy辐射损伤小鼠造血系统的保护作用。方法30只雄性C57BL/6小鼠随机区组法分为对照组、2 Gy照射组和2 Gy照射+DIM组，每组10只。对照组小鼠接受假照射（0 Gy），其余2组小鼠接受2 Gy137Cs γ-射线一次性全身照射。2 Gy照射+DIM组小鼠照射前30 min腹腔注射DIM（75 mg/kg），其余2组小鼠腹腔注射对照溶液。照后7 d和15 d每组取5只小鼠，取外周血进行血象测定，取骨髓细胞测定骨髓有核细胞（BMNCs）数目，活性氧检测探针（DCFH-DA）检测细胞内活性氧（ROS）水平、骨髓粒-单核巨噬细胞集落（CFU-GM）形成数目检测克隆形成能力。结果与对照组比较，2 Gy照射组外周血白细胞、血小板数量、BMNCs数目和克隆形成能力显著下降，细胞内ROS水平显著提高（P＜0.05）。与2 Gy照射组比较，2 Gy照射+DIM组外周血白细胞、血小板数量、BMNCs数目和克隆形成能力显著提高，细胞内ROS水平显著下降（P＜0.05）。结论DIM对小鼠2 Gy照射后造血系统损伤有一定的保护作用，其机制可能与降低骨髓细胞内ROS水平有关。

辐射损伤；造血系统；活性氧；骨髓细胞；小鼠，近交C57BL；3,3′-二吲哚甲烷

吲哚-3-甲醇（indole-3-carbinol,I3C）广泛存在于包括花茎甘蓝、萝卜、大白菜、花椰菜以及水田芥菜等十字花科植物中，I3C是受到咀嚼或浸渍等组织结构破坏时，3-吲哚甲基芸苔葡糖硫苷在内源性黑芥子硫苷酸酶的作用下水解产生的衍生物［1］。

I3C能够在胃酸环境下发生缩合反应，转化为多种低 聚 物 ，包 括 3,3- 二 吲 哚 甲 烷（3,3′-diindolylmethane,DIM）、［2-（吲哚-3-甲基）-吲哚-3-甲基］吲哚-3-甲烷［2（indol-3-ylmethyl）3,3 diindolylmethane,LTr1］、吲哚（3,2b）咔唑［indolo（3,2b）carbazole,ICZ］等［2］。而 DIM 和 LTr1 是 I3C进入体内血清中的主要代谢产物，在肝脏中的I3C各种代谢产物中DIM占24%，LTr-1占20%［3］。因此，I3C的各种生物学效应可能主要应归因于这些多聚体的作用，其中DIM的作用尤为重要。研究发现，I3C及其主要代谢产物DIM可以正向调节电离辐射导致的DNA损伤和修复密切相关蛋白ATM和BRCA1的表达及其磷酸化［4-6］。笔者前期研究发现，DIM可以通过ATM/BRCA1磷酸化的激活，选择性增加正常组织的耐辐射能力，延长受照动物的存活时间，而不影响肿瘤组织的放射治疗敏感性，提示DIM可以作为选择性强、疗效好的辐射防护药物候选药［7］。DIM对4 Gy照射小鼠造血系统辐射损伤具有较好的防护效果［8］。本研究旨在探讨DIM对2 Gy辐射损伤小鼠造血系统的保护作用。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂137Cs γ-射线照射源，剂量率为1.01 Gy/min（Autocell40，加拿大原子能有限公司）；流式细胞仪（BD Accuri C6，美国）；全自动血细胞分析仪（Sysmex，日本）。DIM由美国Georgetown大学化学合成并提供。RPMI-1640培养基、胎牛血清均购自美国Gibco公司。甲基纤维素培养基M3534（MethoCult®GF M3534）购 自 加 拿 大 Stem Cell Technologies公司。活性氧检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。

1.2 实验动物 C57BL/6小鼠30只，雄性，SPF级，8周龄，体质量18～22 g，购自北京维通利华实验动物有限公司，合格证号：SCXK（京）2009-0017，由中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心提供SPF级条件饲养。饲料为清洁级全价鼠料，购自北京科奥协力饲料有限公司。实验动物操作均遵从中国医学科学院放射医学研究所实验动物伦理委员会审定的规范要求。

1.3 方法

1.3.1 动物分组及给药方案 随机区组法将小鼠分为对照组、2 Gy照射组和2 Gy照射+DIM组，每组10只。对照组接受假照射，其余2组进行137Cs γ-射线一次性全身照射，吸收剂量为2.0 Gy，源靶距15 cm。2 Gy照射+DIM组小鼠在照射前30 min腹腔注射DIM 75 mg/kg。对照组和2 Gy照射组给予等体积溶剂。实验过程中，所有动物在同等条件下饲养，自由饮水和摄食。

1.3.2 外周血、体质量及脏器系数的测定 照射后第7天和第15天，从眼静脉丛取外周血于提前加入抗凝剂K3EDTA的EP管中，用全自动血细胞分析仪测定白细胞数、红细胞数和血小板。小鼠称质量后，颈部脱臼处死，75%乙醇浸泡消毒，剥离小鼠的胸腺和脾脏，用精密电子天平称质量，计算胸腺、脾脏系数。脏器系数=脏器质量（mg）/体质量（g）。

1.3.3 骨髓有核细胞（BMNCs）的获取 无菌条件下取小鼠股骨、胫骨，用含2%胎牛血清的PBS缓冲液冲洗骨髓腔，获取骨髓细胞，过滤后进行细胞计数。

1.3.4 骨髓细胞克隆形成能力检测 调整骨髓细胞浓度为1×105/mL，缓慢接种于24孔培养板中，每组6个平行样，37℃，5%CO2培养5 d后判读并计数粒-单核巨噬细胞集落（CFU-GM）数目，≥50个细胞群落为阳性克隆，结果以每单侧股骨生成的CFU-GM数量表示［9］。

1.3.5 骨髓有核细胞内活性氧（ROS）水平检测 调整骨髓细胞浓度为1×105/mL，细胞悬液与活性氧检测探针（DCFHDA）以 1 000∶1的比例加入DCFH-DA，37℃水浴孵育 30 min，离心，弃上清，用无血清RPMI-1640培养基洗涤3次以洗去探针，用无血清RPMI-1640培养基将细胞悬起，流式细胞仪检测平均荧光强度［10］。

1.4 统计学方法 符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用GraphPad Prism 5.0进行统计分析，多组间比较采用方差分析，组间多重比较采用Tukey’s检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DIM对辐射损伤小鼠体质量和脏器系数的影响 3组间体质量比较差异无统计学意义。与对照组比较，照后7 d,2 Gy照射组小鼠胸腺系数和脾脏系数明显低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），2 Gy照射+DIM组小鼠胸腺系数明显高于2 Gy照射组（P＜0.05）；照后15 d时3组体质量及脏器系数差异均无统计学意义。见表1。

2.2 DIM对辐射损伤小鼠外周血象的影响 照后7 d和15 d,2 Gy照射组、2 Gy照射+DIM组白细胞和血小板数量均低于对照组；照后7 d，2 Gy照射+DIM组白细胞、血小板数量高于2 Gy照射组（均P＜0.05）。照后7 d，2 Gy照射组红细胞数量低于对照组（P＜0.05），见表2。

2.3 DIM对辐射损伤小鼠造血功能的影响 照后7 d和15 d，2 Gy照射组、2 Gy照射+DIM组BMNCs数量和克隆形成数量均低于对照组，ROS水平高于对照组，2 Gy照射+DIM组BMNCs数量和克隆形成数量均高于2 Gy照射组，ROS水平低于2 Gy照射组（均P＜0.05），见表3。

Tab.1 Effects of DIM and radiation on the body weight and organ index in three groups表1 DIM及照射对小鼠体质量和脏器系数的影响 （n=5，±s）

Tab.1 Effects of DIM and radiation on the body weight and organ index in three groups表1 DIM及照射对小鼠体质量和脏器系数的影响 （n=5，±s）

＊P ＜ 0.05，＊＊P ＜ 0.01；a与对照组比较，b与 2 Gy照射组比较，P＜ 0.05；表 2、3同

组别对照组2 Gy照射组2 Gy照射+DIM组F体质量（g）7 d 19.10±1.00 18.96±1.76 20.22±1.42 1.169 15 d 22.46±1.90 21.90±2.02 22.30±2.15 0.102胸腺系数（mg/g）7 d 2.43±0.23 1.13±0.20a1.50±0.19ab52.390＊＊15 d 1.88±0.20 1.48±0.19 1.86±0.49 2.489脾脏系数（mg/g）7 d 3.43±0.31 1.68±0.29a2.23±1.07 9.074＊＊15 d 2.56±0.34 2.41±0.19 2.46±0.26 0.402

Tab.2 Effects of DIM and radiation on the peripheral blood of three groups表2 DIM及照射对小鼠外周血的影响 （n=5，±s）

Tab.2 Effects of DIM and radiation on the peripheral blood of three groups表2 DIM及照射对小鼠外周血的影响 （n=5，±s）

组别对照组2 Gy照射组2 Gy照射+DIM组F白细胞（×109/L）7 d 8.44±0.95 2.62±0.22a3.74±0.55ab115.132＊＊15 d 7.30±1.56 2.98±0.46a4.58±0.63a23.471＊＊红细胞（×1012/L）7 d 9.42±0.21 8.65±0.66a9.02±0.41 5.750＊15 d 9.23±0.29 8.74±0.46 9.14±0.24 2.546血小板（×109/L）7 d 714.16±87.40 339.82±43.86a550.43±50.67ab43.562＊＊15 d 801.19±53.41 602.61±54.69a689.56±62.08a15.334＊＊

Tab.3 Effects of DIM and radiation on the hematopoietic function in three gorups表3 DIM及照射对小鼠造血系统功能的影响 （n=5，±s）

Tab.3 Effects of DIM and radiation on the hematopoietic function in three gorups表3 DIM及照射对小鼠造血系统功能的影响 （n=5，±s）

组别对照组2 Gy照射组2 Gy照射+DIM组F BMNCs（×107/根股骨）7 d 2.51±0.08 1.48±0.37a2.09±0.24ab19.911＊＊15 d 2.86±0.17 2.09±0.18a2.42±0.22ab20.502＊＊ROS水平（平均荧光强度）7 d 21 228±1 338 40 261±5 734a31 504±3 896ab27.313＊＊15 d 23 744±1 230 29 746±1 881a26 134±2 678ab11.211＊＊克隆数目（个/105细胞）7 d 120.80±11.99 38.00±8.75a61.80±10.21ab93.020＊＊15 d 107.60±10.21 48.80±8.41a75.20±8.98ab50.887＊＊

3 讨论

随着我国国民经济的迅速发展，核能与核技术在工业、农业、医疗及军事等国民经济各领域的应用日益广泛，核战争、涉核恐怖袭击、地震或海啸等引起核电站发生核泄露，临床上对恶性肿瘤患者进行的放疗以及管理不善或操作失误等因素都可导致放射性工作相关的从业人员、放射事故时事故处理急救人员、军队相关人员以及广大公众受到照射而发生急性辐射损伤。为了减缓急性辐射损伤对人体的危害，研究辐射损伤的防治手段，特别是积极寻找有效的辐射防护药物已成为减少急性辐射损伤和辐射损伤防护研究中迫切需要解决的问题和热门研究课题之一。

急性电离辐射损伤根据受到辐射剂量的大小分为骨髓型、肠型和脑型。骨髓型辐射损伤以造血系统为主要关键病变［11］。造血系统对辐射高度敏感。机体受到辐射后，骨髓细胞的增殖、分裂功能受到损伤，导致血细胞来源减少，从而引起外周血象不同程度的变化［8］。本研究通过测定小鼠外周血常规的变化，观察了辐射及DIM对小鼠造血功能的影响，研究结果显示在2 Gy照射后，外周血白细胞和血小板数量与对照组相比均呈明显减少趋势，而DIM可以提高外周血白细胞总数和血小板数量，尤其是血小板数量有较大幅度升高，这可能与DIM能够提高大剂量辐射损伤大鼠存活率相关［7］。

骨髓是对辐射高度敏感的组织，辐射引起骨髓损伤必将导致骨髓造血细胞的变化［12］。骨髓有核细胞水平的变化在一定程度上反映了骨髓的造血能力。本研究结果表明，C57BL/6小鼠照射后7 d和15 d，DIM可有效减轻小鼠骨髓造血损伤，对骨髓有核细胞有较好的保护作用。DIM能提高骨髓有核细胞数量，表明DIM对辐射损伤小鼠的造血组织有一定的保护作用。克隆形成实验是功能实验，可以检测骨髓造血祖细胞的增殖能力。本研究显示，应用DIM后骨髓细胞克隆形成数量显著提高，造血祖细胞增殖能力增强。电离辐射可以引起细胞内ROS水平升高［13］。ROS是辐射引起造血细胞损伤的主要原因。本研究结果显示DIM可以有效降低骨髓细胞的ROS水平，与之前亚致死剂量照射的研究结果一致［8］。

综上，DIM对2 Gy电离辐射造成的小鼠造血功能损伤具有一定的保护作用，尤其是能提高骨髓有核细胞数量和骨髓细胞克隆形成能力，降低骨髓细胞内的ROS水平。本研究仅从DIM对2 Gy电离辐射小鼠造血系统损伤的角度说明其具有一定的辐射损伤防护作用，但这种保护作用的作用机制及其是否与吲哚-3-甲醇其他衍生物具有协同作用还有待更深层次的研究。

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（2017-04-11收稿 2017-04-28修回）

（本文编辑 李国琪）

Protective effects of 3,3′-diindolylmethane on radiation damage of hematopoietic system in mice

DONG Jia-li,LU Lu,FAN Sai-jun△
Tianjin Key Laboratory of Radiation Medicine and Molecular Nuclear Medicine,Institute of Radiation Medicine,Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College,Tianjin 300192,China△

E-mail:fansaijun@irm-cams.ac.cn

ObjectiveTo investigate the protective effect of 3,3′-diindolylmethane(DIM)on radiation-induced injury in mouse hematopoietic system.MethodsThirty C57BL/6 mice were randomly divided into control group,2 Gy irradiation group and 2 Gy irradiation+DIM group(n=10 for each group).Mice of control group

sham irradiation,and the other two groups accepted 2 Gy137Cs γ-ray total body irradiation.Mice in 2 Gy irradiation+DIM group were intraperitoneally injected 75 mg/kg DIM 30 min before irradiation.Mice of other two groups were treated with reference solution.After 7 d and 15 d of 2 Gy irradiation,the peripheral blood samples were collected to count the number of bone marrow nuclear cells(BMNCs).The level of reactive oxygen species(ROS)was measured by DCFH-DA.The levels of colony forming unitsgranulocyte-macrophage(CFU-GM)were also detected.ResultsThe numbers of white blood cell(WBC),platelet count(PLT),BMNCs and CFU-GM were significantly decreased and the ROS level of bone marrow cells increased significantly in the irradiated group than those of control group(P＜0.05).Compared to 2 Gy irradiation group,the numbers of WBC,PLT,BMNCs and CFU-GM were significantly increased in 2 Gy irradiation+DIM group,and the level of ROS was decreased significantly(P＜0.05).ConclusionDIM has a protective effect on hematopoietic cells following radiation-induced injury,which may be related with the decreased ROS level.

radiation injuries;hematopoietic system;reactive oxygen species;bone marrow cells;mice,inbred C57BL;3,3′-diindolylmethane

R331.2

：A

10.11958/20170457

国家自然科学基金面上项目（81071906，81172127，81572969）；天津市应用基础与前沿技术研究计划青年项目（15JCQNJC46000）；“协和青年基金资助”和“中央高校基本科研业务费专项资金资助”（3332013044）；中国医学科学院、北京协和医学院“中央级公益性科研院所基本科研业务费”（2016RC310016）

中国医学科学院北京协和医学院放射医学研究所，天津市放射医学与分子核医学重点实验室（邮编300192）

董佳丽（1992），女，硕士在读，主要从事辐射损伤防护药物的机制研究

△通讯作者 E-mail:fansaijun@irm-cams.ac.cn